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Log inINTRODUCTION AND OBJECTIVES: Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most diagnosed pediatric cancer. Within ALL, those originating from B precursor cells are the most frequent (B-ALL). The occurrence of specific gene rearrangements is associated with prognostic risk stratification. Among several gene products presenting aberrant expression in ALL, osteopontin (OPN) has been reported. OPN is a matricellular glycophosphoprotein involved in several steps of tumor progression. In B-ALL, our previous data demonstrated that OPNc is the most upregulated OPN splice variant (OPN-SV) in patients harbouring KMT2A-AFF1 fusion, which is a poor prognostic risk biomarker associated with increased relapse risk and central nervous system (CNS) involvement. Moreover, OPNc expression levels were found to be associated with poor prognostic risk features, such as high white blood cell counting and CNS infiltration. In this scenario, the current study aimed to investigate the functional roles of OPN-c in a B-ALL cell line presenting KMT2A-AFF1. MATERIAL AND METHODS: Using the strategy to specifically knock-down OPNc using an antisense DNA oligomer (ASO) anti-OPNc targeting this splice variant, the RS4;11 cell line was transfected with this ASO or with the scrambled DNA control sequence (ASO scramble) using the 4D Nucleofector system. OPNc- silenced cells were then evaluated by RT-qPCR, immunofluorescence, cell adhesion, viability, transmigration and invasion assays.RESULTS AND CONCLUSIONS:. The RS4;11 cells transfected with the ASO anti-OPNc displayed a decrease in 85% of transcriptional expression levels of OPNc in relation to control cells. OPNc-silenced cells also presented an increase of 76% in proliferation rates and a decrease of 41% in cell viability rates at 24h time point. Moreover, these cells displayed a decrease of 55% and 17% in adhesion to matrigel and osteoblasts cell matrix, respectively. Corroborating these results, we found that RS4;11 OPNc-silenced cell also presented a decrease in 54% and 51% of transmigration and invasion capacity through matrigel, respectively. In conclusion, we found that OPNc expression levels in B-ALL cells presenting KMT2A-AFF1 can modulate B-ALL cell proliferation, adhesion, migration and invasion properties. We then hypothesize that upregulated OPNc expression in this leukemia model may control the ability of B-ALL cells to adhere in the bone marrow matrix, which could be a factor related to leukemia relapse, while acquiring invasive properties, possibly associated CNS and other extramedullary sites infiltration, contributing to more aggressive B-ALL phenotypes. Further work should be conducted to better understand OPN-SI mechanism in the CNS involvement.
Daniela R Ney Garcia
Bom dia,
Você acredita que a OPNc poderia ser um alvo terapêutico para pacientes com LLA-B KAMT2A-AFF1 positivos, já existe algum estudo nesse sentido que você tenha conhecimento?
Quais experimentos você faria para avaliar o papel de OPN no acometimento do sistema nervoso central?
Como você chegou à escolha da dosagem de 50nM de anti-OPNc para os seus ensaios?
Daniela R Ney Garcia
Parabéns pelo trabalho, tão bem elaborado e exposto.
Gostaria de fazer mais uma pergunta, vocês pretendem expandir este estudo, talvez em linhagens de LLA-T ou LMA com KMT2A-AFF1, você acha que poderia encontrar alguma diferença nesses subtipos para os mesmos experimentos ou você acha que isso seria irrelevante?
Ana Clara Santos da Fonseca Bastos
Muito obrigada, Dra. Daniela! Sim, a princípio iremos priorizar LLA-B uma vez que essa translocação é frequente em 80% dos pacientes lactentes, um número bastante expressivo, e está associada a recaída. Mas, nosso intuito é também expandir para LLA-T, principalmente por já ser descrito que existe uma elevada frequencia desses pacientes com recaída no SNC. Eu acredito que podemos encontrar algumas diferenças sim, tanto em relação a expressão das isoformas da OPN, que apresentam um perfil de expressão tecido-tumor específico, como também em relação ao comportamento das células de LLA-T em relação ao acometimento do SNC. Digo isso porque já existem alguns estudos na literatura que demonstram uma diferença de correlação de uma mesma proteína com o acometimento do SNC entre coortes de pacientes LLA-B e LLA-T. Sobre LMA é uma ótima ideia, obrigada por essa sugestão e acredito que também possamos encontrar diferenças e que isso seria muito válido pra entender o papel das isoformas da OPN, principalmente da isoforma c, nas leucemias em geral. Muito obrigada pelas considerações!
Antonio Palumbo Jr
A pequena diferença de expressão (não significativa) entre as isoformas de osteopontina, justificaria a escolha da isoforma C?
Como vc poderia explicar o aumento na proliferação das células silenciadas para OPNC, de maneira concomitante com a diminuição da viabilidade?
Pensaria em avaliar os efeitos da superexpressão de OPNC, a fim de validar os achados?
Como poderia incrementar o trabalho em nível translacional e também em nível funcional?
Acha que seria interessante utilizar outras linhagens de B-ALL sem a fusão KMT2A-AFF1 como controle?
Ana Clara Santos da Fonseca Bastos
Olá, Dr. Antonio!
1) Sobre a primeira pergunta, a escolha da OPNc foi devido a comparação que fizemos entre o grupo de pacientes ETV6-RUNX1 (grupo associado a um melhor prognóstico de LLA-B) versus KMT2A-AFF1 (associado a um pior prognostico). Nós valiamos o nível de expressão transcricional das 3 isoformas da OPN nos dois grupos de pacientes e comparamos. Nessa comparacao vimos que a OPNc era a isoforma que apresentava a maior diferenca de expressão transcricional entre esses dois grupos. O dado nao esta sendo demonstrado nessa apresentação, mas pode ser encontrado de uma maneira mais detalhada em nosso paper ali indicado. 2) A princípio justificamos o dado uma vez que acreditamos que essas células podem estar dormentes (proliferando menos) e viáveis. Mas, ainda iremos realizar o ensaio de dormência e tambem citometria com anexina V e PI para confirmar de maneira mais precisa o numero de celulas proliferando como tambem viaveis, não restringindo os dados apenas com azul de tripan e MTT. 3) Sim! Pretendemos fazer a superexpressao da OPNc nessa linhagem para corroborar os dados, já que temos em mãos o plasmidio para a superexpressao e já é uma técnica bem estabelecida pelo grupo em outros modelos tumorais. 4) Como estou no primeiro ano do doutorado, ainda temos muitos ensaios pra fazer, tanto para avaliar a recaída como também o acometimento do SNC. Dentre eles, o ensaio de transmigracao em Câmara transwell através do co cultivo de células endoteliais e astrocitos para mimetizar a barreira hematoencefalica. Nossa intenção é verificar a capacidade das células silenciadas ou não para OPNc em atravessar essa barreira. Também pretendemos avaliar se essas células silenciadas ou não para OPNc se tornam dormentes quando aderidas a matriz de osteoblastos o que poderia implicar na recaída, dentre outros. Quando os ensaios funcionais in vitro estiverem fechados, seguiremos para o in vivo onde poderemos verificar de uma maneira mais translacional o papel da OPNc. 5) Sim! Como já dispomos de duas linhagens de LLA-B, uma com fusão de bom prognóstico (ETV6-RUNX1) e outra sem translocação, a ideia é fazer o mesmo com essas linhagens e comparar os resultados. Espero ter conseguido esclarecer as dúvidas e agradeço por toda a contribuição!
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Ana Clara Santos da Fonseca Bastos
Olá, Dra Daniela!
1) Com base nos nossos resultados, acreditamos sim que a OPNc possa ser um alvo terapêutico, mas é necessário expandir esses achados e fazer outros ensaios in vitro e in vivo para corroborar a nossa hipótese. Até o momento não existe nenhum estudo a respeito da OPNc em LLA-B KMT2A-AFF1 positiva, sendo o nosso trabalho o pioneiro. O que existe é o estudo dessa isoforma como possível biomarcador e alvo terapêutico em outros modelos tumorais sólidos.
2) A ideia é continuar o trabalho realizando experimentos que respondam o processo de recaída e acometimento do SNC. Para o acometimento do SNC, iremos realizar ensaio de transmigração em câmara transwell através do co cultivo de células endoteliais e astrócitos na membrana da câmara, de forma a mimetizar a barreira hematoencefálica. Em seguida, iremos adicionar as células RS4;11 silenciadas ou não para a OPNc na parte superior da câmara e verificar a capacidade dessas células em atravessarem esta barreira. A partir desses dados, pretendemos seguir com os estudos in vivo, fazendo o transplante das células RS4;11 silenciadas ou não para OPNc em camundongos e verificar o acometimento do SNC nos mesmos, através do corte da região craniana e a quantificação do número de células no SNC por FACS ou coloração com hematoxilina e eosina (um protocolo já estabelecido por alguns grupos)
3) Foi realizada a transfecção da linhagem celular RS4;11 com diferentes concentrações (50 e 100nm) de oligomeros anti-OPNc e scramble. Após a transfecção,coletamos as células em diferentes tempos (12h, 24h, 36h, 48h) e realizamos ensaio de PCR em tempo real para avaliar os níveis de expressão transcricional da OPNc. A partir desse ensaio observamos que a concentração e o tempo ótimo de silenciamento dessa isoforma era de 50nM e 36h, respectivamente.
Espero ter conseguido esclarecer as dúvidas,
Muito obrigada