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Abstract
INTRODUCTION AND OBJECTIVES: Lung cancer is, according to PAHO (Pan American Health Organization, 2018), the leading cause of cancer deaths among men and women (about 1.76 million deaths). It is divided into small cell lung cancer and non-small cell lung cancer. The latter, being one of the most frequent, affecting 80 to 85% of lung cancer patients. In addition, it is also the one with the highest mortality rate, commonly associated with smoking. This type of cancer can undergo metastasis affecting other organs. Among the treatments the most common is chemotherapy, patients however, have been presenting resistance to treatment, making the search for effective and alternative therapies necessary. Thus, the discovery of the antitumor potential of plants such as Manilkara Huberi can be a support for chemotherapy treatments with existing drugs or even alone. In this study, the antitumor activity of extracts of Manilkara Huberi, an Amazonian plant, using non-small cell lung cancer was evaluated in order to identify new alternatives to the treatment of non-small cell lung cancer. The extracts were obtained thanks to the partnership with Universidade Federal do Pará. MATERIAL AND METHODS: To analyze the in vitro antitumor activity of extracts, subfractions, called A7, P10 and MHF1, H460 cells were used. Treatment with the subfractions was accompanied by 3-methyladenine, an autophagy inhibitor. The cells were analyzed after 48 hours by fluorescence microscopy to detect ATG12 expression and flow cytometry for cell cycle analysis. RESULTS AND CONCLUSION: Vacuole formation was observed in cells treated with the subfractions, in addition, a statistically significant increase in the percentage of subG1 cells from the treatment with P10 and MHF1 with the inhibitor in relation to those with the extracts only, shows that the inhibitor may be inducing death by apoptosis in the cells. Samples with A7, on the other hand, although showing an increase when combined with the inhibitor, were not statistically significant. Also, the expression of ATG12 was not altered by 3-MA. To completely elucidate the mechanism of action of the extract and fractions, further studies are necessary.
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Author

Beatriz Santos De Oliveira

Olá Fernanda, muito obrigada!!  1- Iniciei o projeto em 2019 durou quase um ano, iniciei meu estagio na faculdade com ele mas infelizmente as atividades no laboratório foram interrompidas por causa da pandemia. 2- A ideia do projeto foi estudar a atividade antitumoral das subfrações nas células, assim como outras integrantes do grupo estudavam subfrações de outras plantas amazônicas. Já se tinha o conhecimento de que as subfrações que eu iria trabalhar poderiam induzir autofagia graças a estudos anteriores do grupo, então o meu projeto começou estudando esse potencial autofágico e os experimentos com as subfrações em conjunto com um inibidor, serviram para provar inicialmente que essa autofagia acontecia a partir da observação dos vacúolos autofágicos na morfologia da célula para que depois eu pudesse avaliar as proteínas envolvidas no processo de autoagia, durante os experimentos com as amostras com subfrações e o inibidor, os vácuolos foram formados mas não chegaram a maturar e minhas células foram encaminhadas por uma morte por apoptose.   3- A expansão da membrana autofágica para a criação do vacúolo é feita pela interação inicial do ATG 12 com o ATG 5, como haviam anticorpos para olhar ATG 12 aproveitei para iniciar os experimentos com ela, futuramente quero investigar as expressões dos outros ATG’s e principalmente a expressão de LC3 para as células apenas com o tratamento com as subfrações. A imunofluorescência foi usada primeiro pois era a técnica que eu melhor dominava, em minhas tentativas anteriores com Western Blotting não consegui extrair resultados por problemas no decorrer do experimento, acredito que uma quantificação de proteínas seja melhor por ele mas para isso preciso repetir mais vezes o experimento e tentar conseguir transferir as proteínas para a membrana e então colocar os anticorpos, nas primeiras avaliações de estagio me foi sugerido que tentasse partir para outros experimentos até conseguir pegar o jeito com Western e por isso eu aproveitei para analisar a morte celular nos experimentos de citometria de fluxo para poder pelo menos avançar com meus resultados e tentar solucionar algumas perguntas que eu já tinha.  
Author

Beatriz Santos De Oliveira

Olá, Annelise! Muito obrigada, fico feliz que tenha achado interessante! Como ainda são experimentos iniciais de um estudo que comecei recentemente na faculdade, ainda não cheguei a fazer ensaios de toxicidade em células não tumorais, esse é um passo futuro mas primeiro, gostaria de estudar melhor a expressão das proteínas de autofagia na célula, para ter provas mais concretas de que os extratos estão induzindo a autofagia. Pretendemos quantificar a expressão de ATG-12 para comparar o melhor efeito do extrato e também investigar e quantificar uma expressão de LC3 nas células que receberam apenas o tratamento com os extratos. Vamos avaliar o efeito das subfrações na expressão de ATG-12 e principalmente estudar mais sobre os efeitos moleculares que o inibidor age na autofagia e na expressão da ATG-12, pelos resultados da figura 2, pude reparar que com o inibidor, o ATG-12 se reuniu todo ao redor do vacúolo autofágico, ele é criado mas não é maturado, enquanto espero para poder voltar com os experimentos no laboratório, tenho estudado na literatura sobre esse inibidor e o que se conhece da ação dele dentro da autofagia, para me ajudar a guiar meus experimentos para solucionar as novas perguntas que surgiram. Sobre as subfrações, elas foram obtidas através de estudos anteriores do meu grupo antes de eu começar meu estágio, os extratos enviados pela parceria da Universidade Federal do Pará foram estudados e a cada extrato bem avaliado a partir do caule, raiz, ou folha da Manilkara Huberi, era separado e fracionado para avaliar uma possível atividade antitumoral, o objetivo era chegar em cada composto e identificar a atividade antitumoral neles, os fracionamentos eram feitos para tentar isolar esse composto, quando é encontrada uma fração com maior atividade, é possível que ali o composto esteja em maior concentração. Algumas frações eram fortes demais e precisaram ser subfracionadas, dando origem a outras subfrações que foram estudadas e avaliadas pelo grupo, como é o caso do P10 e A7. Durante esses estudos anteriores para avaliar a atividade deles é que foram estabelecidos a melhor concentração para usar nas células H460, foi um grande trabalho em conjunto desde o grupo da Universidade parceira, até o grupo da minha Orientadora e quando eu iniciei meu estágio, aprendi mais sobre as técnicas utilizadas pelo grupo e recebi como projeto, estudar a atividade autofágica das frações que demostraram um maior potencial autofágico e assim poder caracteriza-lo. Acredito que ainda é cedo para dizer qual tem o maior potencial para ser usado em tratamentos futuros, já que eu iniciei os experimentos recentemente, possivelmente serei capaz de afirmar depois de estudar melhor a expressão das proteínas ligadas a autofagia e a apoptose ao qual as células se encaminharam após o uso do inibidor.  

Anneliese Fortuna de Azevedo Freire da Costa

Obrigada pelas respostas, Beatriz!   Sucesso com o projeto!!
Author

Beatriz Santos De Oliveira

Gratidão, Annelise!
Institutions
  • 1 Universidade Federal do Rio de Janeiro
  • 2 Universidade Federal do Pará
Keywords
apoptosis
Câncer
H460
autophagy