FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF TRANSCRIPTIONAL-DEPENDENT AND INDEPENDENT ROLES OF CDK9

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  • Presentation type: Pós-Doutorado
  • Track:
  • Keywords: BRCA1; CDK9; CHK2; DNA damage repair; cell cycle;
  • 1 INCA / Pesquisa Clínica / Rio de Janeiro - Brasil
  • 2 INCA, Pesquisa Clínica
  • 3 Pesquisa Clínica, INCA, RJ, Brazil
  • 4 Cancer Epidemiology Program, H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute, FL, USA
  • 5 Instituto Federal do Rio de Janeiro - IFRJ, RJ, Brazil

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Abstract

Introduction and objectives: The DNA damage response (DDR) is a well-coordinated pathway capable of sensing and repairing different types of DNA damage. Double-strand break (DSB) lesions activate the ATM-CHK2 axis, which is responsible for the cell cycle arrest, prompting cells for DNA repair. DSBs are primarily repaired through two distinct pathways: homologous recombination (HR) and non-homologous end-joining (NHEJ). BRCA1 and 53BP1 play an important role in DDR by orchestrating the decision between HR and NHEJ, but the precise mechanisms regarding both pathways are not entirely understood. Previously, our group identified the interaction of the cyclin-dependent kinase 9 (CDK9) with BRCA1 and BARD1 (BRCA1-Associated RING domain 1). CDK9 is a component of the positive transcription elongation (PTEF-b) complex and has been implicated in genome integrity maintenance in replication stress response and HR repair by modulating the BRCA1 recruitment to DSB sites. Material and methods: Here we further characterize the structural basis of the BRCA1/BARD1/CDK9 and CDK9/CHK2 complexes using protein-protein interaction assays. We interrogated the DDR-related role of CDK9 in CHEK2-deficient cells by assessing cell cycle progression, ionizing radiation (IR) and Poly ADP-Ribose Polymerase inhibitor (PARPi) sensitivity. We also assessed the role of the BRCA1/CDK9 interaction and CHK2 proficiency on the CDK9-mediated transcriptional modulation using a luciferase-based transactivation reporter system and in vitro phosphorylation assays. Results and conclusion: Our data indicate that the CDK9/BRCA1 interaction occurs through the BRCA1 N-terminal region in a BRCA1/BARD1 heterodimer formation-dependent manner. We also generated a CDK9 missense mutant (E369A) that abrogates the CDK9/BRCA1 interaction. Interestingly, E369A mutation does not impact on CDK9 role in transcription as shown by the phosphorylation of RNA polymerase II C-terminal domain (CTD), CDK9 transactivation activity and its T-loop phosphorylation. On the other hand, E369A failed to restore the recruitment of BRCA1 to DSB sites. Moreover, we characterized CHK2 as a novel CDK9 interaction partner through ectopic and constitutive protein-protein interaction assays. Cells lacking CDK9 present an altered cell cycle progression after IR treatment. However, as seen for its checkpoint control profile, the sensitivity to IR or PARPi are CHK2-independent phenotypes. We also observed that the CDK9-mediated RNA polymerase II phosphorylation and CDK9 transactivation activity seems to be downregulated in cells lacking CHK2. Additionally, CHK2 deficiency stimulates CDK9 self-interaction, which is a hallmark of PTEF-b inactivation. Collectively, our data suggest that CDK9 acts in the DDR independently of its canonical role in transcription. We also show a putative CHK2-dependent modulation of PTEF-b functions.

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Thales C. Nepomuceno

Oi, Mariana. Obrigado pela pergunta. Segundo dados do TCGA, (e.g. Metabric - Breast cancer) pacientes que apresentam alterações em CDK9, tendem a não apresentar mutações em BRCA1. Recentemente foi demonstrado in vitro, que a inibição de CDK9 pode ser usada para sensibilização de células de ovário ao tratamento com inibidores de PARP (PMID: 32368391).
Author

Thales C. Nepomuceno

Apenas para complementar. O trabalho avalia linhagens de cancer de ovário BRCA1 selvagem.

Mariana Teixeira

Obrigada pela resposta e parabéns pelo trabalho.
Author

Thales C. Nepomuceno

Oi, Murilo. Obrigado pelo interesse no trabalho. Então, a escolha pela HCT116 se deu pelo modelo CHEK2 nulo, para interrogar a função biológica da interação CDK9/CHK2 (Figuras 3 e 4). Os dados sugerem que CDK9 apresente papel na resposta/reparo a danos no DNA em modelos diferentes, tendo em vista que o que demonstramos anteriormente em MCF7, se repete em HCT116. O interessante é que esse papel se mostra independente de CHK2.  Já a questão da citometria, não posso dizer que o que se observa na figura 3F seja poliploidia. Durante a aquisição, essas células se mostram mais como agregados que propriamente poliploidia. Acontece que o output do programa de análise de ciclo celular (ModFit) mostra todos os eventos no plot do histograma. Nessa figura, deve-se considerar somente o histograma em vermelho e branco hashurado.

Murilo Rocha

Entendi Thales. Me referi a poliploidia pois nós irradiamos a HCT116 e já vimos por microscopia e citometria de fluxo a presença de células multinucleadas. Levando isso em consideração, me perguntava de que forma a ausência de CHK2 influenciando a atividade transcricional de CDK9 poderia ter uma influência.
Author

Thales C. Nepomuceno

Entendi. Não acho que seja o caso aqui.  De qualquer forma, pelo exercício da hipótese, não vejo nada que já tenha sido descrito como função de CDK9 (expressão de algum gene específico) que possa responder essa questão. Seria algo que teríamos que olhar mais de perto. Do ponto de vista do papel de CHK2 no controle transcricional, essa observação não é 100% nova. Existe um controle por meio da fosforilação de CDK11. Mas o contexto desse controle ainda não está claro.  

Murilo Rocha

Dei uma checada rápida agora e vi alguns trabalhos que associam poliploidia e deficiência de CHK2 (este por exemplo PMID: 2203062). Essas células você tem aqui ou os experimentos foram feitos lá no Moffit? Vou dar uma olhada mais a fundo nesses trabalhos e qualquer dia desses podemos conversar a respeito.
Author

Thales C. Nepomuceno

Obrigado pelo PMID. Vou olhar com calma. Mas, como falei anteriormente, não estamos vendo poliploidia nesse caso.  
Author

Thales C. Nepomuceno

Esqueci de dizer que os experimentos foram feitos durante o período do sanduíche, sim.