FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF A SET OF IN-FRAME INDEL AND C-TERMINAL NONSENSE VARIANTS OF BRCA1

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Details
  • Presentation type: Mestrado
  • Track:
  • Keywords: BRCA1; variants; Functional Assays;
  • 1 Instituto Nacional de Câncer
  • 2 INCA / Pesquisa Clínica / Rio de Janeiro - Brasil
  • 3 Pesquisa Clínica / INCA / Instituto Nacional de Câncer
  • 4 Outros

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Abstract

INTRODUCTION AND OBJECTIVES: BRCA1 is a tumor suppressor gene that plays a central role in DNA repair by homologous recombination. Carriers of pathogenic mutations in BRCA1 are predisposed to the hereditary breast and ovary cancer syndrome (HBOC). BRCA1 encloses two tandem BRCT domains (tBRCT) in its C-terminal region. The tBRCT domain is crucial for BRCA1-mediated tumor suppression as the loss of its last 11 amino acid residues results in cancer predisposition. Thus, nonsense or frameshift variants are usually classified as pathogenic. However, missense mutations, small in-frame deletions and/or insertions (indels) are known as variants of uncertain significance (VUS). Functional assays are powerful tools for assessing the impact of variants on specific protein function. Our group showed that BRCA1 tBRCT domain integrity correlates to its transcriptional activity (TA). We have previously evaluated more than 300 missense variants enclosed within the C-terminal region (1396-1863 amino acid residues, coded by exons 13 to 24) of BRCA1 using the TA assay. However, little is known about the functional impact of small in-frame indels and nonsense mutations on the C-terminal border of the tBRCT domain. MATERIAL AND METHODS: In-frame indels previously reported in the population were identified through the BRCA Exchange platform. We selected and generated all 16 in-frame indels reported in the 13/24 region that resulted in single amino acid variation (SAV) or single codon deletion (SCD). We also generated 8 nonsense truncation variants in the C-terminal border of the tBRCT domain. Variants were generated by site-directed mutagenesis using pCDNA3:GAL4 DNA binding domain (DBD):BRCA1 as template. The functional impact of variants was interrogated by the TA assay in human HEK293FT cells using known benign (S1613G) and pathogenic (M1775R and Y1853X) variants as controls. Protein expression was evaluated by immunoblotting. RESULTS AND CONCLUSION: All variants were successfully generated and evaluated by TA assay and immunoblotting. Indels located within the tBRCT domain (amino acid 1650 to 1863) that resulted in SAV presented up to 50% of WT activity. However, SAV in the disordered region next to the tBRCT presented activity that exceeded 100% of wild-type (wt), similar or higher than benign variant S1613G. Similarly, the SCD in the tBRCT domain resulted in complete loss of TA. The SCD located in the disordered region presented activity ranging from 55% to 110% of wt activity. Interestingly, the loss of a single amino acid in the C-terminal border of the tBRCT resulted in a 50% decrease in TA activity. This phenotype is also observed in previous studies interrogating the absence of 2 to 6 amino acids. However, the loss of residues P1856 and Q1857 showed markedly reduction in TA. Collectively, our data corroborate the notion that TA correlates to tBRCT domain integrity. We also show that the disordered region seems to tolerate SCD without affecting TA.

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Ana Paula Fernandes Paz dos Santos

Oi Jamila, obrigada pela atenção e pelas perguntas! Vou respondê-las em tópicos: 1. Todas as mutações abordadas no trabalho foram descritas na população, em baixíssima frequência. Daí a necessidade de avaliá-las, já que não podemos inferir a patogenicidade delas por linkage, por falta de informação populacional acerca delas. A exceção são as 8 mutações na borda C-terminal do tBRCT de BRCA1. Elas foram geradas especificamente para questionar a importância desse domínio para a proteína, e qual o limite de deleções de aminoácidos que ainda mantem a funcionalidade da proteína. Logo, elas não são mutações naturais, foram geradas para essa interrogação específica.  2. O immunoblotting apenas nos mostra os níveis proteicos dessas variantes, mas nosso grupo já observou que os níveis de proteína e a atividade transcricional por recrutamento da RNA Polimerase II das variantes, que é como avaliamos funcionalmente, não estão correlacionadas quanto à patogenicidade. Variantes com níveis proteicos normais se mostram potencialmente patogênicas, e vice-versa Outro experimento para avaliação funcional dessas variantes seria o de interação com proteínas como PALB2, já descrita por interagir no domínio coiled-coil de BRCA1, mediando o complexo BRCA1-PALB2-BRCA2, fundamental para o reparo de DNA por recombinação homóloga, processo no qual BRCA1 é essencial.  3. A aplicação da avaliação funcional da variante clinicamente se dá pela contribuição dessas informações funcionais a um modelo multifatorial de classificação de variantes de significância incerta. Esse modelo, além de agregar dados funcionais, também agrega dados genéticos, e interação com algoritmos, como o VarCall. O VarCall utiliza dados de ensaios funcionais para classificar as variantes. Uma vez classificadas, elas agregam informação sobre a patogenicidade da variante, ajudando nas decisões clínicas a serem tomadas para o tratamento dos carreadores da mutação. 4. Sim, trabalhos mais recentes mostraram que é possível realizar mutageneses em modelo animal, para posteriormente avaliar o impacto de funções canônicas de BRCA1, como o impacto na recombinação homóloga, e até mesmo a resposta dessas variantes ao tratamento com inibidores de PARP.   Espero ter sanado as dúvidas!

Jamila Alessandra Perini Machado

Muito obrigada pelos esclarecimentos. Parabéns e sucesso com o trabalho!
Author

Ana Paula Fernandes Paz dos Santos

Obrigada pelas perguntas!  1. No momento o objetivo é avaliar o impacto delas na função da proteína, especialmente pelo tBRCT. Uma questão que torna as VUS um desafio de classificação são justamente a baixa frequência delas na população, no entanto, o entendimento da patogenicidade dessas variantes acrescenta à informação populacional, caso elas ocorram em outros indivíduos, de fato.  2. Para interpretar os dados, utilizamos a construção selvagem de BRCA1, a qual mostra 100% de atividade transcricional, avaliada pelo ensaio de gene repórter (luciferase) como controle não patogênico. Nós traçamos um threshold de 50% da atividade do selvagem, e as variantes que mostram menos de 50% da atividade transcricional relativa, concluímos possuir potencial patogênico.  3. São sim, as proteínas que interagem com a região de reconhecimento de porteínas fosforiladas são geralmente alvos das quinases ATM e ATR, como CtiP, BRIP1, BACH1 e p53.  4. Eu realizei todas as etapas do estudo, com exceção dos WB, devido aos problemas com a covid19. 5. Algumas das perspectivas são de fazer análises de interação proteica para melhor entender o impactos dessas VUS, além de avaliar um novo set já descrito de indels, e aplicar esses resultados no algoritmo VarCall, que utiliza um modelo Bayesiano para classificar essas variantes. Espero ter sanado as dúvidas, obrigada!

SANDRA KONIG

Obrigada pela resposta Ana Paula. Peço desculpa, percebo que nem me apresentei. Sou Sandra Konig do ICB na UFRJ e estava avaliando o seu trabalho.  No que diz respeito a minha 2a pergunta, o queria lhe perguntar na verdade é como vc poderia explicar que mutações similares em regioes proximas no Cter tenham os efeitos contrarios na TA? Sugestoes? Obrigada.
Author

Ana Paula Fernandes Paz dos Santos

Oi Sandra, desculpa pela demora na resposta, tive problemas com a plataforma em reagir à sua nova pergunta. Entendo, uma possibilidade para atividades de transcrição diferentes de mutações similares em regiões próximas é a relevância daquele resíduo de aminoácido para função da proteína. Nesse caso, um resíduo de aminoácido trocado ou deletado algumas posições antes ou depois de outro pode mostrar um papel importante para o recrutamento da RNA Polimerase II, enquanto o resíduo próximo não, tanto que deletado ou trocado, mantém a função de recrutamento.  Espero ter esclarecido, e novamente, desculpa a demora da resposta à sua pergunta. 
Author

Ana Paula Fernandes Paz dos Santos

Para complementar, alguns resíduos estão próximos linearmente, mas podem estar espacialmente separados na conformação terciária da proteína, tendo diferentes impactos na estrutura da proteína. Assim, um resíduo em uma posição próxima linearmente pode ser mais relevante no recrutamento da RNA Pol II, que o outro, que pode estar, por propriedades bioquímicas, mais longe da região que induz o recrutamento. A relevância de diferentes resíduos de aminoácidos em regiões próximas pode ser observada inclusive na conservação deles em sequências ortólogas.