EXPRESSION PATTERNS OF OSTEOPONTIN SPLICE VARIANTS IN COLORECTAL CANCER CELL LINES

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Details
  • Presentation type: MS - Master's student
  • Track: Molecular Biology
  • Keywords: Osteopontin; colorectal cancer cell; splicing variants;
  • 1 INCA
  • 2 INCa/ Laboratório de Oncobiologia Celular e Molecular
  • 3 Oncobiologia / INSTITUTO NACIONAL DE CANCER / Instituto Nacional de Câncer
  • 4 Universidade Federal Fluminense/ Laboratório de Biomarcadores Neoplásicos

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Abstract

INTRODUCTION AND OBJECTIVES: Osteopontin (OPN) is an extracellular matrix protein overexpressed in several tumor types, including colorectal cancer (CRC). The primary OPN transcript undergoes alternative splicing, generating the splicing variants (OPN-SV), called OPNa, OPNb and OPNc, and the more recently described OPN4 and OPN5. Although total OPN (tOPN) roles in CRC progression and as a biomarker are already known, the contribution of each OPN-SV in CRC has not been investigated. Therefore, this study aims to characterize the expression profile and the possible functional roles of OPNa, OPNb and OPNc in CRC cell lines.
MATERIAL AND METHODS: The CRC tumor cell lines Caco-2 (differentiated phenotype), HT-29 (moderate phenotype of differentiation) and HCT-116 (undifferentiated phenotype) have been used to evaluate the transcriptional profile of OPNa, OPNb and OPNc by means of qualitative and quantitative RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction). RT-PCR assays were performing using OPN-SV specific oligonucleotides and β-ACTIN as housekeeping gene control. The transcriptional expression of each investigated OPN-SV and the overall survival were also examined by in silico analysis using GEPIA 2 (http://gepia2.cancer-pku.cn) and TVSdb database (http://www.tsvdb.com). Functional evaluation of these OPN-SV was investigated by transfecting Caco-2 cell line with pCR3.1 expression vector containing the complete cDNA of each OPN-SV or the empty vector control plasmid. Cell proliferation rates was evaluated by trypan blue staining assays.
RESULTS AND CONCLUSION: Among the OPN-SVs evaluated in Caco-2, HT-29 and HCT-116 cells lines, OPNa is the most expressed variant (p<0.05). Moreover, we also observed a higher expression of OPNa, OPNb and OPNc isoforms in HCT-116 lines and HT-29 in relation to Caco-2 cells. These data suggest that the highest OPNa expression levels may be associated with the most undifferentiated phenotype of CRC cell lines. By using in silico expression analysis, we found that the three isoforms OPNa, OPNb and OPN are overexpressed in CRC tumors when compared to non-tumor samples. This analysis also showed that OPNa is overexpressed in tumor samples in relation to the other two tested splice variants. When compared to OPNb and OPNc, OPNa is also upregulated in primary, recurrent and metastatic colorectal tumors, as well as in CRC more advanced pathological stages. Moreover, higher expression levels of these three OPN-SV are associated to poor overall survival in CRC patients. Accordingly, Caco-2 cell lines stably overexpressing OPNa displayed higher proliferative rates than those cell clones overexpressing OPNb or OPNc. Further functional studies will be performed using these cell clones ectopically overexpressing these OPN-SVs to better comprehend their roles in CRC biology.

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Daniella Mattos

Olá Mariana, obrigada por perguntar. Algo que podemos fazer para reverter esse cenário seria transfectar nessas linhagens vetores de inibição (siRNA) dessa proteína e observar os efeitos gerados por esse silenciamento. 

 

Author

Daniella Mattos

Olá Patricia, muito obrigada por sua pergunta e considerações. Respondendo sua pergunta, após superexpressas a linhaguem Caco-2 com os vetores estáveis contendo a sequencia para OPNa, OPNb, OPNc e a sequencia controle ( VV) fiz uma analise por RT- PCR e em relação ao controle, havia o aumento de expressão das variantes transfectadas. Então foi gerado um pool de células transfectadas, ou seja, a gente compreende que no meio desse pool existem células que superexpressas mais OPNa, B ou C e outras que expressam menos. A nossa proxima ideia é isolar clones desse pool, analizar se eles estão expressando a OPN de interesse e realizar os ensaios funcionais com as células obtidas dele. Mas como experimento preeliminar, utilizamos o pool transfectado para fazer o ensaio de proliferação. Fazendo assim creio que veremos essa diferença estatificamente significativa

 

Patricia Possik

Oi Daniella! Perfeito! Entendi. Acho que quanto mais Robusto seu sistema, melhor para observar estas diferenças. Por isso perguntei dos níveis. Mas vejo que você já tem um plano considerando isso! 

 

Boa sorte! 

Author

Daniella Mattos

Muito obrigada pela contribuição, Patricia !

Author

Daniella Mattos

Olá Thayana, boa tarde ! Muito obrigada ! O TVSdb é uma ferramenta que utiliza os banco dados de RNAseq presentes no TCGA, além do seu uso ser muito simples e prático. 

Obrigado por perguntar 

Thayana da Conceição Barbosa

Ótimo! 

Esta ferramenta só disponibiliza RSEM ou vocês que optaram por utilizá-lo? Por que não RPKM?

Author

Daniella Mattos

É, essa ferramenta só disponibiliza o RSEM mesmo..

Thayana da Conceição Barbosa

Entendi.  Obrigada pelas respostas!

Author

Daniella Mattos

Olá Thales, obrigada por perguntar. Para superexpressar as isoformas utilizamos vetores plasmidias que contem a sequência das OPN-SV de interesse acoplado a uma sequencia gênica do antibiotico de seleção (geneticina). Esse vetores são englobados e carreados para a célula através da solução de lipofectamina, que permite que o vetor entre na célula de interesse. Em seguida o vetor se incorpora ao genoma. E para avaliar a se a superexpressão foi eficiente, nós fizemos RT-PCR, e em relação ao controle confirmamos que as variantes estavam sendo altamente expressas. E sim, é possivel silenciar essas isoformas. Inclusive nosso grupo já tem experiencia com o silenciamento por RNA de interferência. 

Thales C. Nepomuceno

Legal. Então vocês fazem utilizam um pool de células heterogêneo, com uma ou mais cópias do plasmídeo. Certo?

Você pretende avaliar o impacto do silenciamento dessas isoformas na proliferação celular?

Thales C. Nepomuceno

Legal. Então vocês fazem utilizam um pool de células heterogêneo, com uma ou mais cópias do plasmídeo. Certo?

Você pretende avaliar o impacto do silenciamento dessas isoformas na proliferação celular?

Author

Daniella Mattos

Sim, foi isso. O proximo passo é isolar clones desse pool heterogeneo, verificar se continuam superexpressando as variantes de interesse para poder realizar os estudos funcionais. E também pretendemos silenciar essas variante para corroborar com os possiveis achados.

Thales C. Nepomuceno

Obrigado pelas respostas. Boa sorte com os experimentos

 

Author

Daniella Mattos

Muito obrigada, Thalles !

Author

Daniella Mattos

Sim, são dados bem interessantes ... Sim, conseguimos fazer pelo TSVdb

Thayana da Conceição Barbosa

Legal! Acho que poderiam fazer para verificar se o impacto se mantém nos diferentes estadiamentos. Parabéns novamente! Sucesso pra ti!

Author

Daniella Mattos

Um boa ideia ! Obrigada pela contribuição, Thayana ! Desejo o mesmo para ti!