O tamarindo é bem adaptado ao território brasileiro sendo produzido em todas as regiões do país, porém, é pouco explorado e boa parte da sua produção é destinada ao consumo interno. Apesar de possuir grande potencial para aproveitamento industrial a semente de tamarindo ainda é pouco aproveitada nas indústrias alimentícias. O objetivo do trabalho foi adaptar e validar um método para quantificação de ácidos graxos do óleo da semente de tamarindo colhido em 3 diferentes regiões do Brasil (Minas gerais, São Paulo e Bahia), das safras de 2012 e 2013. Utilizou-se o método de Bligh-Dyer para obtenção do óleo da semente. As análises para quantificação dos ácidos graxos do óleo da semente de tamarindo foram realizadas em Cromatografia Gasosa acoplada a um detector de ionização de chamas (CG-FID) e confirmados em espectrômetro de massas (GC-MS), após esterificação das amostras. A programação da temperatura do forno foi inicialmente de 50ºC por 1 min, aquecendo para 175ºC a uma taxa de 25ºC min-1 e posteriormente aumentando para 230ºC a uma taxa de 4ºC min-1, totalizando 35,5 min de corrida. No total, dez diferentes ésteres metílicos de ácidos graxos do óleo da semente foram quantificados por padronização interna e 9 confirmados em GC/MS. O ácido linoleico (18:1n-6, cis) apresentou as maiores concentrações, variando de 145 até 270 mg.g-1s.s., seguido pelo ácido oleico que variou de 31 a 83 mg.g-1s.s. Os ácidos mirístico e α-linolênico tiveram as menores proporções em relação aos outros ácidos graxos encontrados no óleo da semente de tamarindo, com variações entre 0,35 e 1,07 mg.g-1s.s e 0,40 à 1,45 mg.g-1s.s, respectivamente. A variação nos resultados mostraram que a origem dos frutos e os fatores climáticos do local de produção têm grande influências na composição de ácidos graxos do óleo da semente de tamarindo.