A enzima β-galactosidase (lactase) tem especial importância para indústria de alimentos e farmacêutica, por hidrolisar a lactose em glicose e galactose, sendo utilizada na preparação de alimentos com baixo teor de lactose. A obtenção dessa enzima de forma recombinante permitirá a obtenção de maiores quantidades de lactase com um custo menos elevado. O objetivo deste trabalho foi clonar o gene da β-galactosidase de Kluyveromyces sp. para ser expresso em E. coli. DNA foi extraído a partir de uma cultura de Kluyveromyces, em meio YEPD, para realização da amplificação do gene da lactase, utilizando oligonucleotídeos iniciadores específicos. Nesta etapa foram realizados testes utilizando diferentes temperaturas de anelamento na reação de amplificação do DNA pela Pfu DNA polimerase (50, 55, 60, 63 e 65°C) e concentrações de 0%, 2,5%, 5% e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). O DNA amplificado foi purificado a partir do gel e ligado a um vetor de clonagem (pCR®-Blunt). Células de E. coli (DH10B) foram transformadas por eletroporação com o DNA de interesse e seu DNA plasmidial foi extraído para sequenciamento das extremidades, mostrando que o gene da β-galactosidase de Kluyveromyces sp. foi clonado. Após ser amplificado com oligonucleotídeos contendo sítios para as enzimas de restrição NdeI e XhoI, o gene foi clonado em um vetor de expressão (pET30a(+)) e sequenciado por completo. A sequência obtida apresentou 99% de homologia com o gene para lactase. Como perspectivas, serão testada diferentes condições de cultivo para a superexpressão da β-galactosidase recombinante de Kluyveromyces sp. em E. coli.