Eletrodo de ouro modificado com PAMAM para análise da constante de interação com β-lapachona

A β-lapachona (βLP) é um fármaco antitumoral bastante promissor e que encontra-se na fase II dos testes clínicos1, que devido a sua baixa solubilidade em água realizou-se o estudo de encapsulação da quinona com dendrímeros, mais especificamente o poliamidoamina (PAMAM), imobilizado na superfície do eletrodo de ouro, devido a capacidade deste polímero de formar complexos de inclusão com substâncias bioativas, baixa toxicidade e um ótimo sistema de liberação de fármacos2. As medidas eletroquímicas foram realizadas em um potenciostato/galvanostato da Methrom Autolab®, em um sistema de três eletrodos, em que o eletrodo de trabalho foi um eletrodo de ouro, como eletrodo auxiliar um fio de platina e como eletrodo de referência o sistema Ag|AgCl|Cl-, pela a técnica de voltametria cíclica. As análises foram realizadas utilizando como eletrólito suporte uma solução de sulfato de sódio 0,2 mol L-1 e 5% de etanol. Para calcular a constante de interação entre o dendrímero e βLP, o eletrodo de trabalho limpo foi modificado com MUA e MUA/PAMAM de geração 2 (G2). Para isto o eletrodo foi imerso por 24h em uma solução metanólica de MUA, em seguida o eletrodo foi lavado com metanol e então imerso em solução metanólica contendo EDC e PAMAM G2 por 12h. A concentração da βLP, que foi variada, e os valores de corrente gerados pela interação da βLP com eletrodo modificado com MUA e MUA/PAMAM G2 foram utilizados para calcular a constante de equilíbrio com o dendrímero (K) e o número de sítios ativos (n). Os resultados experimentais obtidos foram utilizados na equação de Scatchard-Klotz3 adaptada, que forneceu os valores de K = 2,9x104 e n = 22,77. Observando os voltamogramas gerados nota-se uma interação da quinona com o PAMAM muito maior e significativa com eletrodo MUA/PAMAM do que com apenas MUA ou sem modificação, que pode estar ocorrendo por encapsulamento desta droga, devido as cavidades internas vazias do PAMAM que o tornam capaz de encapsular moléculas da βLP em seu interior. Observa-se também um maior valor de corrente de redução, por uma provável estabilização do radical gerado durante a redução da βLP e também uma menor reversibilidade do processo, que pode ser atribuída a uma interação eletroestática entre este radical e os grupamentos aminos que estão protonados neste pH (7,0). O estudo eletroquímico mostrou-se bastante significativo, rápido e eficaz para determinar a constante de interação entre eles e avaliar como esta ocorre. Os resultados aqui obtidos corroboram com estudos de FTIR e UV-vis previamente realizados pelo grupo. In this study, the electrochemical behavior of a new BODIPY based fluorescent naphthoquinone with potent antitumour activity [1] was investigated by cyclic voltammetry (CV). The characterization of the reduction mechanism is fundamental to the understanding of the cytotoxic effects and mechanism of action of this novel hybrid compound. This new compound behaves as a fluorescent probe in subcellular localization studies [1]. CV experiments were performed in a conventional three-electrode cell. The working electrode was a glassy carbon (GC) BAS (d = 3 mm), the counter electrode was a Pt wire and the reference electrode, an Ag|AgCl, Cl− (saturated). Compound 1 was composed of two non-conjugated main reducible systems, the orthodihydrofuran- naphthoquinone (nor-beta-lapachone) and the boron-dipyrromethene, (BODIPY) separated by a methylene spacer. The electrochemical profile of the compound is presented in figure 1A. The first reduction is represented by two redox systems, the first, well-defined, diffusional and quasi-reversible (Ic/Ia), at potentials of -0.535 V and -0.407 V and the second, ill-defined, better visualized at higher scan rates (1 V s-1) (IIc/IIa). This behavior is representative of the quinone system, where disproportionation occurs, at slow scan rates, leading to the hydroquinone dianion (Fig. 1A and 1C , marked in red). The other reduction wave (IIIc), at -1.901 V (Fig. 1A and 1C, in blue), is related to the reduction of the heterocyclic system and leads to an aromatic ring and a very stabilized radical, which is oxidized at the potential IIIa (-0.009 V), as shown by inversion potentials (Fig.1A). This is a very interesting and complex redox system, represented by the scheme in figure 1C. The proposed mechanism is proved in figure 1B through combined CVs of nor-β-lapachone and BODIPY. This molecule constitutes a promising prototype owing to its potential biological activities and imaging capability aimed to performing mechanistic investigations in cells and in vivo, and opens up an interesting avenue of research. Os aumentos nas taxas de AU têm sido associados a várias doenças, dentre estas, as mais conhecidas são a gota, diabetes, colesterol alto, pressão arterial elevada, doença de Lesch-Nyan e doenças cardíacas1. Sendo assim, é de grande importância o monitoramento desse analito no organismo como forma de prevenção e tratamento a tais enfermidades. Neste contexto, o trabalho investiga a utilização de plataformas eletroquímicas contendo filmes poliméricos derivados do ácido 4-aminosalicico (4-AMS) para imobilização da enzima Urato oxidase (UOx) visando aplicação na quantificação de ácido úrico (AU) em amostras de urina. A eletrodeposição do 4-AMS foi realizada pelas técnicas de voltametria cíclica (VC) e cronoamperometria (CA) sobre eletrodos de grafite (EG). Por VC foram realizados 100 ciclos de potencial na faixa de -0,25 a 1,25 V à 50 mV/s em solução 2,50 mM do monômero preparado em H2SO4 0,50 M. Utilizando a CA, a eletropolimerização foi realizada a potencial constante de +0,928 V durante 5600 s no mesmo meio reacional utilizado na VC. O poli(4-AMS) obtido por VC e CA mostrou dois pares redox, os quais estão relacionados a eletroatividade do filme polimérico, na região de potencial de +0,50/+0,40 V. Contudo, maiores valores de Ipa e Ipc foram obtidos para os eletrodos modificados por VC, sugerindo que estes filmes são mais eletroativos. A deposição do azul da Prússia (AP), mediador da reação de peróxido, foi investigada sobre os EG, com posterior modificação com poli(4-AMS). Notou-se que a presença do AP não altera o perfil voltamétrico da eletropolimerização do 4-AMS. Contudo, quando comparada com a eletropolimerização somente nos EG, obteve-se filmes mais resistivos e com menor eletroatividade. Analisando as propriedades eletroquímicas e morfológicas, por VC conseguiu-se filmes mais uniformes, com maior quantidade de material depositado e maior eletroatividade. A eletropolimerização foi realizada também sobre eletrodos impressos de grafite contendo azul da Prússia (EI/AP), onde posteriormente imobilizou-se 5 U da UOx, e o biossensor foi acoplado a uma célula de fluxo num sistema FIA de linha única. A vazão e o volume da alça de amostragem foram otimizados em 2,10 mL/min e 200 μL, respectivamente. O valor de pH da solução do analito foi otimizado em 8,27. Medidas de reprodutibilidade mostraram desvio padrão de 2,15% (n=10). O biossensor respondeu linearmente para AU na faixa de 1,0 x 10-5 a 2,0 x 10-4 M, com limite de detecção estimado em 3,0 μM. Amostras de urina foram diluídas (1:10) e injetadas diretamente no biossensor. A reposta foi reprodutível mostrando baixo desvio padrão para as medidas, e valores encontrados dentro da faixa esperada para o analito em amostras de urina. Testes de adição e recuperação mostraram valores de 97,35% (±2,43). Drogas citostáticas são substâncias citotóxicas utilizadas no tratamento do câncer com finalidade de bloquearem a sequência metabólica de células. Seu mecanismo de ação envolve desde interação, fragmentação até oxidação das bases do DNA, onde o produto principal da oxidação é a formação da 8-oxoguanina. Diversas substâncias são empregadas no tratamento do câncer, as quais se incluem os alquilantes polifuncionais, os antimetabólitos, os antibióticos antineoplásicos e os inibidores mitóticos. O objetivo desse trabalho foi o desenvolvimento de um microchip eletroforético de baixo custo de fabricação e miniaturizado, capaz de realizar testes triagem de compostos que possam provocar lesões no DNA, tais como fragmentação, abertura das fitas e oxidação das bases com formação da 8-oxoguanina. Para isso, foi desenvolvido um sistema eletroforético a base de capilar de sílica fundida, com detecção eletroquímica, utilizando um fio de ouro como eletrodo de trabalho, prata como referência e platina como auxiliar. Foram realizados testes com algumas substâncias, dentre elas a doxorubicina um antibiótico antineoplásico da classe das antraciclinas, um agente intercalante e oxidante do DNA e o timol um composto natural que causa toxidade ao DNA. A α-Lapachona foi usada como controle negativo. Para as análises de dsDNA com doxorubicina no microchip foram utilizados nos potenciais de +500 V por 5 s para injeção, +1500 V para separação e para detecção +0,4 V. As análises foram realizadas em tampão borato, pH 9,5. Foi realizada uma redução da quinona por 60 s para a geração da semiquinona da doxorubicina. As análises com dsDNA na presença de timol foram realizadas em tampão TAE (Tris-Acetato-EDTA) no microchip utilizando polaridade reversa e potenciais de -500 V por 10 s para injeção, -500 V para separação e para detecção +0,8 V em análises com gel de agarose 0,1%. Foi realizado também AFM em MICA modificada com dsDNA, utilizando poli-L-lisina para validar os resultados obtidos no microchip. Com os dados obtidos em microchip eletroforético com a doxorubicina foi possível identificar um pico de oxidação da guanina após 50 s, que posteriormente foi comprovado pela adição de padrões de 8-oxoguanina. Para o timol foi identificado diversos picos, provavelmente provenientes da fragmentação e exposição das bases da macromolécula de dsDNA. As imagens de AFM mostram que o dsDNA com poli-L-lisina na MICA está bem distribuído sobre toda a superfície apresentando altura de 1 nm e após a adição do timol apresentaram alterações de conformações das fitas de dsDNA formando assim fragmentos com alturas de 0,5 nm, confirmando assim os resultados obtidos no microchip. O método mostrou-se promissor para verificar toxicidade de moléculas ao DNA.