Anais da Jornada Brasileira de Ressonância Magnética
Anais da XVI Jornada Brasileira de Ressonância Magnética

DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DA PROTEÍNA DE MEMBRANA NS2B DO VíRUS DA ZIKA

*Beatriz R. Penna1, Thamires Moreira2, Danielle M. P. O. Santos2, Cristiane D. Anobom2, Ana Paula Valente1
1Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil; 2Dept. de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil
*[email protected]

Palavras-chave: proteína de membrana, ZIKV, ressonância magnética nuclear

O vírus da Zika (ZIKV) emergiu como um importante problema de saúde pública global devido ao surto de ZIKV em 2015. A infecção pelo ZIKV pode causar doenças neurológicas graves, como a microcefalia fetal e síndrome de Guillain-Barré em adultos. O ZIKV produz uma proteína não estrutural transmembranar, NS2B, que é responsável pelo ancoramento da protease NS3 na membrana do retículo endoplasmático e atua como cofator para a sua atividade biológica, coordenando sua conformação ativa. Esse complexo enzimático NS2B-NS3 é responsável pelo processamento da poliproteína viral, logo, possui um papel crucial na replicação do vírus, tornando-se um alvo atraente para o desenvolvimento de drogas antivirais [1]. Entretanto, o domínio transmembrana da NS2B, alvo deste estudo, permanece desconhecido. Portanto, todas as informações estruturais relacionadas a esse domínio serão de grande relevância para a compreensão da patogênese do ZIKV e de outros flavivírus. Desta forma, o objetivo deste trabalho consiste na determinação estrutural da proteína transmembrana NS2B livre e ligada à protease NS3 do ZIKV através de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) em solução. Para isto, a NS2B de ZIKV foi clonada no plasmídeo pET28a, expressa em E. coli BL21 (DE3) e purificada através de cromatografia de afinidade a níquel. Os estudos estruturais por RMN da proteína-alvo foram realizados em micela de Dodecil Sulfato de Sódio (SDS), utilizando o Bruker Avance III HD 900 MHz. Os experimentos bidimensionais [1H,15N] TROSY-HSQC da proteína NS2B mostraram espectros com boa dispersão do deslocamento químico e picos bem definidos, característicos de uma proteína enovelada. O assinalamento das ressonâncias do backbone da NS2B foi realizado através da abordagem sequencial de tripla ressonância usando a proteína marcada [13C, 15N, 2H] e os experimentos Trosy-based HNCO, HN(CA)CO, HNCA, HN(CO)CA, HNCACB, HN(CO)CACB, além do 2D [1H,15N] TROSY-HSQC. Como resultado, 95% do esqueleto carbônico foi assinalado, exceto as prolinas e os aminoácidos S35, E36, V37, L38, M81, Y82, S101, L133,C137, I142, A143, I144, F146, A147, A150 que apresentam proximidade sequencial às prolinas. A predição da estrutura secundária foi feita através do programa Talos-N, utilizando os valores de deslocamento químico de HN, N, Cα, Cβ e CO como entrada para a análise. Os resultados mostraram a presença de 4 α-hélices no domínio transmembrana e 3 elementos de fita-β na porção hidrofílica que é consistente em à estrutura cristalográfica relatada anteriormente, e também para outros flavivirus [1,2]. Os experimentos de dinâmica (T1,T2 e hetNOE) já foram adquiridos e processados, e, atualmente, estão sendo analisados, bem como os experimentos para assinalamento das cadeias laterais. Desta forma, estes resultados são promissores indicando que o cálculo estrututral da NS2B será realizado em breve. Além disso, os estudos de interação e de dinâmica do complexo NS2B-NS3 permitirão a triagem de compostos líderes através da utilização de bibliotecas de fragmentos visando o desenvolvimento de novos compostos antivirais.
Referências:
[1] Z. Zhang et al., Science, 2016,10.1126/science.aai9309.
[2] Y. Li et al., Biochimica et Biophysica Acta, 2015,1848, 2244–2252.
Agradecimentos: FAPERJ, CNPq, CAPES.