SYNTHETIC SYSTEMS FOR CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS (CARs) EXPRESSION CONTROL
Vol 1, 2020 - 131321
IC - Undergraduate Students
Abstract
INTRODUCTION AND OBJECTIVES: Chimeric antigen receptors (CARs) are artificial molecules developed to mimic TCR activation. The use of CARs to redirect T cell responsiveness towards molecules expressed on the tumor has already proved effective, although their therapeutic use still holds some issues needing to be addressed. Among these is the “on-target, off-tumor” effect, where CAR-T cells end up killing healthy cells expressing the target molecule. Hypercytokinemia, where the excessive amount of cytokines generated by the CAR-mediated immune response may lead to a variety of symptoms that can lead to patient death, is another concern. To address these issues, we here develop a new, orthogonal, light-responsive synthetic system as a mean to control CAR expression. Our system uses a LOV domain to control an exogenous transcription factor (TF) fused to it. Upon light exposure, the LOV domain exposes a strong nuclear localization sequence (NLS), leading to TF translocation to the nucleus, inducing CAR expression on the modified T cells on a light-dependant manner. Using this system, we will evaluate the effects of modulating one of the most commonly researched anti-CD19 CARs, which has already shown results in clinical trials. MATERIAL AND METHODS: The sequences for the artificial systems were synthetized and cloned on the plasmid for the sleeping beauty integration system. Genes of interest (GOI) under the control of the system were either cloned on the same plasmid or in separate constructs for gene delivery. Mean fluorescence intensity (MFI) for the GOI were evaluated in different hours after Jurkat cells were electroporated with the transgenes. RESULTS AND CONCLUSION: So far our artificial system shows a far superior GOI expression intensity on its activated state when compared to a standard promoter used for CAR expression. This finding together with the delta of expression between it’s on and off state indicates promising functionality. We detected high basal expression levels, and system improvements must be developed to avoid stimulus-independent system activation. The system is undergoing a first round of optimization before moving on to CAR expression, CAR-mediated T cell activation and cytokine release assays.
Institutions
- 1 INSTITUTO NACIONAL DO CANCER
Track
- Cellular Biology
Keywords
Immunotherapy
CAR-T cell
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Brenno Sessa
Olá,
A modulação é feita através de duty cycles, sendo o tempo "ativo" o tempo de exposição a luz. Nos ensaios que fizemos até o momento, como estamos validando e otimizando o sistema, estamos trabalhando com 0 ou 100%, todo o tempo exposto, ou sem exposição alguma a luz. O controle pode ser feito através da modulação do duty cycle, como por exemplo 20%, passando 0,2 segundos exposto a luz e 0,8 no escuro. Essa regulação nos ensaios é feita por um aparelho que temos, que é montado sobre as placas de 6, 12 ou de 96 poços com fundo escuro.
Brenno Sessa
Quanto os sistemas são basicamente dois, compostos por proteínas fotossensíveis que funcionam de formas distintas. Em um deles você possui uma alfa hélice retida pela proteína, que é exposta quando ocorre exposição a luz. Nessa alfa hélice se encontra a sequência de localização nuclear, que vai transportar a proteína para o núcleo. Fusionado a ela nós temos uma sequência de exportação que independe desse estímulo, e o os domínios de ligação ao DNA e transativação. Esse é o modelo A da figura 1. O segundo sistema por outro lado usa duas proteínas já localizadas no núcleo, que realizam uma heterodimerização em resposta a luz, como em um deles você tem o domínio de ligação ao DNA e no outro o de transativação ele é muito parecido com um modelo de duplo híbrido.
Mariana Acquarone de Sá Lopes
Entendi! muito interessante.
Claro, para essa fase inicial de validação, realmente deve ser a melhor estratégia trabalhar com 0 ou 100%, e em fases mais avançadas ir testando outras opções. Vocês tiveram uma indução na experssão compatível com outras técnicas "clássicas" de indução?
você ainda esta na iniciação, então terá bastante tempo para testar. Qual a ideia que você tem para o futuro? já pensam em testes in vivo, ou ainda seria muito prematuro?
Brenno Sessa
No momento inicial, quando estávamos pensando sobre como fazer esse projeto nós chegamos a pensar em como ele seria executado em um modelo in vivo. Nós recorremos a literatura sobre experimentos in vivo envolvendo optogenética. Já haviam alguns modelos de como isso poderia ser feito, e nós pretendemos usa-los como base. Agora, quanto a compatibilidade da indução, nós desenhamos tanto o promotor artificial, quanto os fatores de transcrição tendo em mente o maior fold-induction possível. Por isso, nós já esperávamos que o nosso máximo de indução fosse maior que um dos promotor padrão usado para expressar CARs, o MSCV'U3, e que talvez tivéssemos um ruído de expressão basal. O máximo que nós temos hoje realmente superou um pouco as nossas expectativas, mas veio com uma indução basal muito fora do aceitável. Parte disso eu pessoalmente credito a expressão dos fatores de transcrição, usamos promotores fortes para eles,. Nós estávamos produzindo variações dos sistemas antes do início da pandemia, justamente para fazer esse ajuste.