Ionizing radiation modulates miR-34a and miR-125b expression in a glioblastoma-derived TP53 wild type cell line
Details
- Presentation type: MS - Master's student
- Track: Molecular Biology
- Keywords: miRNA; Glioblastoma; Radioresistance;
- 1 INCA / Instituto Nacional de Câncer
- 2 Instituto Nacional de Câncer
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Introduction and objective: Glioblastoma (GBM) is the most incident and aggressive subtype of malignant tumors in the central nervous system. Resistance to therapy and poor overall survival are well-known remarks. Standard treatment is tumor resection combined with radio- and chemotherapy, which induces DNA damage. TP53 is known as the genome keeper, which regulates cells response to DNA damage. MicroRNAs (miRNA) regulate gene expression post-transcriptionally by binding to a mRNA what leads to translation inhibition. Among miRNAs, miR-34a is downregulated in GBM samples and directly activated by p53, while miR-125b is a direct inhibitor of p53 in response to DNA damage. Moreover, our group demonstrated that high expression of p53, a surrogate marker of TP53 mutation, are related with better response to radiotherapy. In this context, our goal is to investigate miR-34a and miR-125b roles in radiation response of GBM cell lines with distinct TP53 status. Materials and methods: Three GBM cell lines with different TP53 status were exposed to 2, 4, 8, 16 and 24Gy of ionizing radiation to evaluate cell cycle and DNA fragmentation by flow cytometry. Western Blot was used to evaluate target proteins of miR-34a and p53 levels after ionizing radiation. miR-34a and miR-125b expression was evaluated by qRT-PCR. Finally, a marker of DNA damage (γH2Ax) was evaluated by immunofluorescence. Results and conclusion: Previous data demonstrated that 8, 16 and 24Gy of ionizing radiation induced more DNA fragmentation in cell lines TP53 mutated (U251 and T98G) in comparison to wild type (WT) TP53 cells (A172). Then, we selected the dose of 8Gy to evaluate the induction of double strand breaks (DSB) quantified by γH2Ax focus. We observed γH2Ax focus in 100% of A172 and U251 cells after 30 min. However, A172 cells presented an early resolution of γH2Ax focus, which reduced after 1h while U251 cells focus were maintained for 6h. Moreover, 48h after exposure to ionizing radiation, around 30% of cells still presented γH2Ax focus. Therefore, our results suggest that WT p53 cells present faster response to DNA damage than the mutated p53. These data corroborate our findings that patients with TP53 mutated can benefit from radiotherapy. We also observed lower basal levels of miR-34a in the resistant cell (A172) in comparison to sensitive one (U251), while miR-125b presented similar basal levels. Preliminary data showed that miR34a, miR-125b and p53 expression levels increased after exposure to 8Gy of ionizing radiation in A172 cells. Although miR-34a and miR-125b have described antagonistic roles in DNA damage response, our preliminary data points to an enhancement of both miRNAs associated with WT p53. To clarify the role of these molecules in radiotherapy response, we are going to modulate their expression before treatment. In conclusion, our results indicate that ionizing radiation induces miR-34a and miR-125b expression in a GBM-derived radioresistant TP53 WT cell line.
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Igor de Oliveira Carvalho
Bom dia! Muito obrigado pelo elogio, fico feliz que tenha gostado da apresentação. Sobre as questões vou respondendo em cada tópico.
1- Para a modulação dos miRNAs vou fazer uma transfecção deles nas células, atualmente nosso protocolo de transfeccção é transiente, mantendo seu efeito por cerca de 3 dias. Para a superexpressão iremos utilizar miRNAs miméticos e antagomiR como agonistas para a inibição.
2- Iremos analisar a expressão de algumas proteínas envolvidas na morte celular que já foram demonstradas como alvos desses dois miRNAs como PUMA, survivina e BCL-2, além de BAK e p53 e algumas mais especificas da apoptose como PARP clivada e caspase-3 utilizando o Western Blotting. Mas também iremos utilizar esferoides dessas linhagens que serão irradiados e avaliaremos essas proteínas através de ensaio de imunocitoquímica. Com relação ao dano do DNA será avaliado a expressão de RAD51 e yH2AX por imunofluorescência.
3- Nesse projeto do mestrado não iremos realizar estudos in vivo, por conta do tempo para execução e questões práticas da metodologia para irradiar os camundongos. Mas é uma perspectiva que temos em vista para o desenvolvimento futuro do projeto.
4- Nós já consideramos essa possibilidade de utilizar os dados do TCGA para algumas analises, porém não temos uma grande expertise em bioinformática para realizar essa avaliação. Mas quando tivermos bem consolidada as ideias principais para utilizar esses dados poderíamos colaborar com o grupo de Bionformática do INCA, chefiado pela Drª Mariana Boroni, que tem uma grande experiência na área. Com relação ao miRNA dos pacientes, já temos alguns tumores em parafina de pacientes e pouco antes da quarentena estávamos iniciando a extração desses tumores da parafina e os ensaios de qRT-PCR e temos alguns dados iniciais sobre a expressão do miR-34a e miR-125b nesses pacientes e iremos retomar essas analises em breve.
Isabella Guimarães
Igor, muito obrigada pelas respostas. Boa sorte na execução do projeto! E parabéns novamente pela apresentação!
Igor de Oliveira Carvalho
Obrigado pelo elogio e pelas perguntas que vão ajudar a trazer novas perspectivas pro projeto. Espero ter conseguido responder todas de forma satisfatória.