Proceedings of Oncobiology Symposiums
Proceedings of XIV Oncobiology Symposium

Bom dia. Muito obrigada!
O teste de estabilidade através de ensaios de redução de MTT é um teste colorimétrico que avalia células metabolicamente ativas. Nesse ensaio, após plaquear as células e realizar os tratamentos com as substâncias em tempos definidos, o meio de cultivo das células é trocado por MTT diluído em meio na concentração de 5mg/ml, e deixo incubando na estufa por 3,5h. Nesse tempo, as células metabolicamente ativas vão ser capazes de reduzir tetrazólio, que é amarelo, em cristais de formazan, que são de cor roxa. Essa redução ocorre principalmente nas mitocôndrias das células. Após incubação, onde há células viáveis, é possível observar coloração roxa. O MTT é então substituído por solução solvente, e após total dissolução dos cristais, é levado pra leitura a 590nm num espectrofotômetro de microplacas. Cor mais intensa significa maior número de células viáveis. Os resultados obtidos são utilizados para calcular a porcentagem de viabilidade celular e fazer a estatística no programa prisma.

Em relação a estabilidade, as células da linhagem de carcinoma SCC9 são plaqueadas e incubadas até confluência. Concomitantemente, a concentração de 2xIC50 das substâncias e dos controles DMSO e carboplatina são diluídas em meio de cultivo e incubadas na estufa, a 37º e 5% de CO2, nos tempos determinados (0, 1, 6, 12 e 24h). Meio puro também é utilizado como controle (100% de viabilidade). Após o tempo de incubação, as substâncias são retiradas da estufa e usadas para tratar as células, e após o tempo de tratamento é realizado o teste de viabilidade celular por redução de MTT, como descrito na mensagem anterior! Assim, é possível saber se após os tempos de incubação as substâncias continuaram sendo citotóxicas. No meu experimento, as substâncias testadas (CUME16 e CUME17) demonstraram ser estáveis em comparação com o controle de carboplatina.

Olá, Isabel!
Esse teste visa avaliar estabilidade de atividade citotóxica das substâncias, e não especificamente da estabilidade química das substâncias.
Respondendo sua pergunta, é possível saber se o efeito citotóxico é da substância ou de algum subproduto recuperando a substância após os tempos de incubação e analisando a integridade por métodos como HPLC ou espectometria de massas, mas não sei te dizer como seria feito em substância diluída. Nosso grupo de pesquisa ainda está trabalhando em avaliar a estrutura química das substâncias após os tempos de incubação.

Nós utilizamos 2XIC50 para conseguir ver um efeito citotóxico maior, e, se houvesse perda da atividade da substância, conseguir ver uma maior variação nos resultados. Já respondendo a sua pergunta, ainda não sabemos porque não marcou núcleo picnótico e tivemos marcação de caspase, se estaríamos talvez perdendo o tempo do núcleo picnótico. Não fizemos outros tempos, só os que foram apresentados no trabalho mesmo. Mas é uma questão importante, e isso vai ser discutido (os resultados de caspase são bem recentes ainda).

Olá, Fabio. Muito obrigada! 1) Esses resultados são inéditos no nosso grupo de pesquisa, e são muito recentes, mas serão discutidos. Existe a possibilidade de estarmos perdendo o tempo do núcleo picnótico, então poderíamos fazer outros tempos de marcação com DAPI para esclarecer. Outros testes vão ser realizados para caracterizar melhor a molécula mais promissora (CUME16) em relação a indução de morte, alvos moleculares e parâmetros farmacocinéticos. Ensaios In Silico já estão sendo realizados, com um possível estudo de docking e pretendemos realizar ensaio de toxicidade aguda in vivo. Um vídeo das células sobre ação da CUME16  também está sendo produzido em colaboração, e vai permitir que possamos ver a morfologia e organização das células em tratamento.

2) A síntese das moléculas foi realizada em colaboração com o Instituto de Química da UFF Niterói. As moléculas utilizadas neste trabalho são inéditas, mas outras moléculas similares são descritas na literatura. Tanto quinonas, quanto triazóis e cumarinas possuem diversas atividades biodinamicidas desmonstradas em estudos, incluindo propriedades antitumorais. Os triazóis estão presentes em vários medicamentos da clínica, incluindo antineoplásicos. Então, já existem trabalhos sobre a atividade citotóxica de moléculas dessas classes. Ainda faremos ensaios para descobrir mecanismo de ação e alvos moleculares dessas substâncias testadas, como respondi mais acima.

3) As diferentes linhagens de carcinoma oral são de pacientes diferentes. Os fibroblastos utilizados são gengivais primários saudáveis de humano, obtidos pela ATCC (ATCC® PCS201 018™).  As células de carcinoma são imortalizadas.

Obrigada, Elaine! Outros estudos vão ser realizados para melhor compreendermos os mecanismos de ação da substância mais promissora (CUME16). Estudos in silico já estão sendo realizados, com um possível estudo de docking. Também vamos discutir outros ensaios para determinarmos via de morte induzida, e ensaio de toxicidade aguda in vivo. A substância considerada mais promissora (CUME16) foi escolhida após uma triagem inicial, pois demonstrou maior atividade citotóxica e maior seletividade dentre as outras substâncias testadas. Outros testes subsequentes também tiveram bons resultados em comparação aos controles.