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INTRODUCTION AND OBJECTIVES: Ouabain is a steroid produced by mammals in stressful situations. Recent studies have shown its role in the modulation of B and regulatory T cells, which negatively regulate antitumor responses. Therefore, our main objective was to study if ouabain, by the modulation of lymphocytes in vivo, improves the response to murine melanoma. MATERIAL AND METHODS: The C57Bl/6 mice were divided into 4 groups: a control group (injected with DMEM medium), a ouabain group (injected intraperitoneally with 0.56mg/Kg of ouabain for three consecutive days), a melanoma group (injected with 106 melanoma cells) and a melanoma plus ouabain group. Two experimental protocols were performed: in one, the melanoma cells were injected intraperitoneally and in the other, the cells were subcutaneously injected. In addition, the time of the ouabain injection also underwent variations with animals being injected before (pre-treatment) or after the tumor (post-treatment) in order to approach the clinical reality. On the 21st day after injections, euthanasia was performed to remove the organs, followed by flow cytometry cell analysis. RESULTS AND CONCLUSION: Regulatory T lymphocytes were reduced in the spleen after in vivo pre-treatment with ouabain in the intraperitoneal tumor protocol. Moreover, in the intraperitoneal pre-treatment, it was observed that ouabain maintains the number of B lymphocytes in the spleen and improves animal survival. In the same tumor protocol, but post-treated with ouabain, the reduction of TCD4+, TCD8+, and B lymphocytes was observed regardless of the treatment with ouabain. In the subcutaneous tumor model post-treated with ouabain there was the tendency, although not statistically significant, of total B and T lymphocytes reduction in the spleen and no alterations in the lymph nodes. The ouabain did not interfere directly in the in vitro viability of melanoma cells. In conclusion, ouabain acts as an immunomodulator, improving the survival of animals with melanoma only in previous treatment in the intraperitoneal tumor protocol.
Vitor Hugo Luna Rocha de Almeida
A ouabaína é descrita como um inibidor da Na+/K+ ATPase. Qual o mecanismo que explica os efeitos na imunomodulação de linfócitos?
Vitor Hugo Luna Rocha de Almeida
O uso de inibidores de checkpoint imunológicos (anti-CTLA4, anti-PD-1 e anti-PD-L1) ganharam grande relevância na terapia antineoplásica, por inibirem esses "freios" imunológicos, estimulando a resposta imune anti-tumoral mediada por linfócitos T.
Uma vez que a ouabaína inibe as funções de linfócitos B e Treg, qual o efeito desse composto sobre outras células imunes, em especial linfócitos T CD8 e Th1?
Paula Hesselberg Damasco
De início, destaco que a ouabaína não inibe a função do linfócito B. Além disso, nós observamos a redução da população da Treg, em que ainda não testamos se a ouabaína inibe Treg. Oua não reduziu às cels TCD8 e não testamos, especificamente, no perfil Th1, nem usamos inibidores de checkpoint.
Vitor Hugo Luna Rocha de Almeida
Obrigado Paula. Achei que a ouabaína tinha efeito, pois li isso no abstract: "Recent studies have shown its role in the modulation of B and regulatory T cells, which negatively regulate antitumor responses". Obrigado pelos esclarecimentos.
Paula Hesselberg Damasco
A modulação que a ouabaína exerce nos linfócitos B é referente à manutenção numérica dessas células pela Oua, mesmo nos animais portadores de melanoma. Nesse sentido, a Oua não modula a funcionalidade, nem inibe os linfócitos B, pois em outro trabalho do grupo, demonstramos que a produção de anticorpos por esses linfócitos está preservada.
Vitor Hugo Luna Rocha de Almeida
Por que os autores identificam os linfócitos B na figura 2 como IgM+ e B220+ e na figura 4 utilizam a marcação para CD19?
Paula Hesselberg Damasco
Essa marcação se deu dessa forma, pois um dos anticorpos acabou durante a execução dos experimentos. Destaco ainda que, ambas as moléculas podem ser utilizadas para identificar os linfócitos B,pois os níveis de expressão de ambas nesses linfócitos é semelhante.
Vitor Hugo Luna Rocha de Almeida
Os autores concluem "Ouabain acts as an immunomodulation and improves the survival of animals with melanoma only in the intraperitoneally injected pre-treated protocol".
Qual a sobrevida dos camundongos que receberam o pré-tratamento de ouabaína no protocolo subcutâneo de implantação das células B16F10? E a sobrevida dos camundongos que foram tratados com ouabaína após o estabelecimento do tumor nos protocolos i.p. e s.c.?
Paula Hesselberg Damasco
Em relação à sobrevida, no modelo subcutâneo os animais de todos os grupos sobreviveram até pelo menos o dia 20 e todos foram eutanasiados no dia 21. No modelo i.p., com injeção posterior de Oua, os animais começaram a morrer no décimo quarto dia, não tendo diferença entre os grupos.
Vitor Hugo Luna Rocha de Almeida
Interessante! Esses dados da sobrevida com tratamento posterior com ouabaína no modelo i.p. poderiam estar no pôster, reforçando a importância do pré-tratamento e da imunomodulação antes do estabelecimento do tumor. Obrigado!
Vitor Hugo Luna Rocha de Almeida
Paula Hesselberg Damasco
Boa noite, Vitor Hugo. Obrigada pelas perguntas e sugestões! Nós não acrescentamos o gráfico de sobrevivência do pós tratamento com a Ouabaína por conta da limitação de espaço no pôster. Nós procuramos priorizar os resultados com diferenças estatisticamente significativas.
Paloma Souza
Olá Paula,
Boa Tarde! Parabéns pelo seu pôster.
Gostaria de fazer algumas perguntas.
1- Há quanto tempo você desenvolve esse projeto?
2 - Vocês pretendem fazer um co-tratamento utilizando quimioterapia padrão para melanoma e ouabaína?
Obrigada
Paloma Souza
Paula Hesselberg Damasco
Oi Paloma, Boa tarde e muito obrigada! Estou no projeto desde março de 2019, quando entrei no laboratório como aluna de iniciação científica. Nós não havíamos pensado em fazer um co-tratamento, mas fica como uma sugestão interessante que poderemos tentar viabilizar. Aproveito para agradecer a sugestão! Paula Damasco
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Paula Hesselberg Damasco
Sim, nós não testamos as vias, mas não é via inibição da bomba, pois a Digoxina, que também inibe a bomba, tem efeitos opostos aos da Oua nos animais. Outros trabalhos que estudaram a Oua em linfócitos mostraram que a mesma inibe MAP Kinase, NFKB por exemplo.
Vitor Hugo Luna Rocha de Almeida
Interessante. Obrigado Paula!