ACQUIRED RESISTANCE TO BRAF INHIBITOR SENSITIZES MELANOMA CELLS TO CHK1 INHIBITION-INDUCED REPLICATION STRESS
Details
- Presentation type: DR - Doctoral Student
- Track: Cellular Biology
- Keywords: BRAF; Chk; Melanoma;
- 1 Imunologia e Biologia de Tumores / Pesquisa experimental e translacional / Instituto Nacional de Câncer
- 2 Division of Molecular Oncology and Immunology / Netherlands Cancer Institute
- 3 Bioinformática e Biologia Computacional / Pesquisa experimental e Translacional / Instituto Nacional de Câncer
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INTRODUCTION AND OBJECTIVES: BRAF mutations are frequent in melanoma and contribute to disease progression. BRAF inhibitor (BRAFi) treatment leads to rapid regression of melanoma metastases. However, therapy resistance is imminent and represents an important clinical challenge, underscoring the need for new therapeutic targets. Checkpoint kinase 1 (Chk1) is essential in cell cycle regulation and DNA damage response signaling and is currently explored as a potential target in cancer. Here, we investigated Chk1 as a therapeutic target in BRAFi-resistant (BRAFiR) melanomas using GDC0575, a specific Chk1 inhibitor (Chk1i). MATERIAL AND METHODS: We addressed Chk1i sensitivity by comparing BRAFiR melanoma cells to their respective parental cells. We analyzed cell viability/death by CellTiter-Blue assay and Caspase 3/7 cleavage quantification. To monitor cell cycle progression, cells were labeled with a fluorescent cell cycle indicator system and analyzed by flow cytometry and time-lapse microscopy. To investigate the effects of Chk1i on DNA replication, we analyzed nucleotide incorporation by flow cytometry and DNA fibers assay and measured the levels of pRPA and yH2AX by western blotting. We assessed the in vivo effect of Chk1i in a human melanoma xenograft model. To identify the mechanisms involved in this sensitivity, we analyzed DNA/RNA sequencing of parental and BRAFiR cells. RESULTS AND CONCLUSION: We demonstrated that BRAFiR cells are hypersensitive to Chk1i compared to their respective parental melanoma cells in vitro and in vivo. Monitoring of cell cycle progression showed a percentage of BRAFiR cells unable to complete cell division upon Chk1 inhibition. These data also indicated that S phase progression is crucial for Chk1i-induced cytotoxicity. BrdU staining showed that Chk1i-treated BRAFiR cells partially failed to incorporate nucleotides during S phase, whereas this effect was minimum in parental cells. However, DNA fibers assay revealed decreased fork speed rate for both parental and BRAFiR cells upon Chk1i treatment. We also observed that Chk1i induced a greater increase in pRPA and yH2AX in BRAFiR cells than in parental melanoma cells. Although Chk1i induces replication stress in both BRAFiR and parental, we identified that these effects are more pronounced in BRAFiR cells, which accumulated higher levels of DNA damage, suggesting that these cells die after failing to recover from Chk1i-induced replication stress. Analyses of mutations and gene expression alterations related to BRAFi-resistance and Chk1i-sensitivity are ongoing. These results may help to identify biomarkers for Chk1i sensitivity and contribute to the development of more efficient therapeutic approaches for BRAFiR melanomas.
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Danielle Carvalho
Boa tarde, Dr. Igor Petrone! Agradeço pelas perguntas e elogios!
1. Como você bem ressaltou, no nosso trabalho utilizamos 4 pares de linhagens de melanoma, todos compostos por uma linhagem resistente ao inibidor de BRAF e sua respectiva parental, que nunca foi exposta ao inibidor. Desses 4 pares, em 3 deles as linhagens resistentes ao inibidor de BRAF são hipersensíveis ao inibidor de Chk1 (888melR, A375R e M026R) e a excessão é o par D10. Embora esse fenótipo de hipersensibilidade seja observado nos 3 pares, nós selecionamos o par 888mel para realizar experimentos funcionais mais complexos, como o monitoramento do ciclo celular pela marcação com o sistema FUCCI e a avaliação do estresse na replicação pelo ensaio de filamentos de DNA (DNA fibers assay). Essa escolha foi baseada nos valores de IC50 que obtivemos com o tratamento com o inibidor de Chk1, em que a diferença entre parental e resistente é mais discrepante no par de linhagem 888mel, sugerindo que a caracterização dos efeitos da inibição de Chk1 seriam melhor identificados nesse par de linhagem. Entretanto, pretendemos realizar estes experimentos também com os outros pares utilizados no trabalho.
2. O experimento in vivo foi realizado em camundongos imunodeprimidos NSG. As células de melanoma parentais e resistentes ao inibidor de BRAF foram inoculadas de forma subcutânea e o tratamento com o inibidor de BRAF foi iniciado no dia 1 após a inoculação. Assim, o aparecimento do tumor não foi confirmado previamente ao início do tratamento, porém nos camundongos dos grupos controle (na ausência do inibidor de Chk1) foi observado elevado crescimento tumoral, assim como nos camundongos inoculados com a linhagem parental e tratados com o inibidor de Chk1, enquanto que nos animais inoculados com as células resistentes ao inibidor de BRAF o crescimento tumoral foi retardado pelo tratamento com o inibidor de Chk1, indicando maior sensibilidade desses tumores ao tratamento.
Espero ter respondido suas perguntas de forma clara! Fico à disposição para qualquer esclarecimento! Att, Danielle Carvalho.
Igor Petrone
Obrigado pelos esclarecimentos e parabéns, mais uma vez, pelo excelente trabalho!