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Log inINTRODUCTION AND OBJECTIVES: Tob2 (transducer of ERBB2, 2) is a protein from BTG/Tob family mainly involved in mRNA deadenylation mediated by CCR4-Not Complex. Although Tob2 is considered as an antiproliferative protein and a tumor suppressor, its role in tumor cells and tumor transformation is almost unknown. In this study we investigated the role of Tob2 modulation in tumor cells and non-tumor cells and the association between Myc and Tob2. MATERIAL AND METHODS: MDA-MB-231 (breast cancer), H460 (lung cancer) and in non-tumor cell line HEK293T were used to evaluate the basal levels of Myc and Tob2. Real time PCR and Western blotting (Wb) were applied to evaluate mRNA and protein levels respectively. Human Tob2 was cloned to a plasmidial vector in order to evaluate the effect of transient overexpression in the cell lines and the siRNA assay was performed to inhibit Tob2. Tob2 overexpression and inhibition was evaluated in MDA-MB-231, H460 and HEK293T. The proliferative effects of Tob2 overexpression or Tob2 inhibition was evaluated by crystal violet assay, clonogenic assay and Trypan blue assay. The association between Myc and Tob2 expression was investigated in tumor cells and in non-tumor cell line after Tob2 overexpression and was also evaluated in the B-cell line P493-6 that presents Myc promotor responsive to tetracycline. RESULTS AND CONCLUSION: Our results demonstrated that HEK293T presents higher levels of TOB2 transcripts compared to MDA-MB-231 and H460 cells, while H460 and HEK293T present higher levels of MYC mRNA, compared to MDA-MB-231. Western blotting evaluation demonstrated that H460 presents higher levels of Myc protein compared to the other adherent’s cells evaluated. Moreover, Tob2 overexpression in MDA-MB-231, H460 and HEK293T cell lines increased both cellular proliferation and clonogenic potential. Confirming these data, Tob2 inhibition in the same cells showed the opposite effect, leading to cell proliferation and clonogenic potential decrease. Besides, our data demonstrated that the genic silencing of Myc treatment induced higher Tob2 levels in P-4936 cells. Additionally we observed that Tob2 overexpression in MDA-MB-231 and HEK293T cells reduced Myc expression. Taken together, our data indicates that Tob2 may play a role in cellular proliferation induction in some tumor and non-tumor models. Furthermore, we hypothesize the presence of a negative feedback between Myc and Tob2 expression, but this feedback may not be associated to the novel Tob2 role in cell proliferation induction.
Vitor Hugo Luna Rocha de Almeida
Como os autores conciliam os dados de expressão basal de TOB2 da figura 1C com os das figuras 2B/C/D? Na figura 1C, células HEK293T apresentam a menor expressão proteica de TOB2 entre as linhagens do painel testado e já na figura 2D, estas mesmas células transfectadas com o vetor vazio apresentam uma banda de TOB2 considerável no WB.
Vitor Hugo Luna Rocha de Almeida
Os autores têm alguma pista do mecanismo de regulação negativa entre TOB2 e c-Myc? Esse mecanismo pode estar relacionado com a deadenilação do mRNA de c-Myc por TOB2?
Thaís Hancio Pereira
Olá, obrigada pelo questionamento! Ainda não sabemos se essa regulação ocorre de maneira direta ou indireta, mas nossa hipótese é que Tob2 regula negativamente Myc através da deadenilação de seu mRNA, como já foi observado por Ogami e colaboradores em 2014 (doi:10.1038/onc.2012.548), ao passo que Myc pode regular Tob2 através da expressão do miR-378, como observado por Feng e colaboradores em 2011 (doi: 10.1038/onc.2010.602).
Vitor Hugo Luna Rocha de Almeida
Muito interessante!
Vitor Hugo Luna Rocha de Almeida
Como os autores conciliam o aumento da proliferação das células transfectadas com TOB2 e a redução da expressão de c-Myc, uma vez que c-Myc é um oncogene associado à transformação celular e proliferação?
Thaís Hancio Pereira
Olá, obrigada pela pergunta! Nós hipotetizamos que o aumento da proliferação nas células transfectadas com Tob2 seja independente do possível mecanismo de regulação entre Myc e Tob2, visto que nem todas as linhagens apresentam diminuição de Myc mediante superexpressão de Tob2, mas todas elas apresentam aumento na proliferação celular avaliada por cristal violeta e/ou aumento do potencial clonogênico mediante superexpressão. Dessa maneira o aumento de proliferação nessas células está relacionada ao aumento de Tob2, mas ainda não sabemos por qual mecanismo Tob2 está influenciando positivamente da proliferação celular.
Vitor Hugo Luna Rocha de Almeida
Eu chutaria um palpite: TOB2 poderia estar promovendo a deadenilação do mRNA de algum gene supressor de tumor, causando instabilidade e degradação do mesmo. Obrigado Thaís!
Thaís Hancio Pereira
Muito interessante, nunca tinha pensado em Tob2 levando a deadenilação do mRNA de um supressor tumoral, levando a essa instabilidade. Vou levar isso em consideração! Muito obrigada pelo palpite!
Recentemente saiu um trabalho que mostra que a fosforilação de Tob2 em diferentes resíduos pode inibir ou aumentar a sua ligação à maquinaria de deadenilação, e isso teria impacto na proliferação celular por essa mudança global de mRNAs (doi: 10.1261/rna.073528.119). Nosso chute iria mais ou menos por essa linha, em relação ao mecanismo pelo qual ele estaria atuando como indutor de proliferação.
Vitor Hugo Luna Rocha de Almeida
Como os autores explicam a dissonância entre o ensaio de proliferação celular por cristal violeta e a contagem total de células?
Thaís Hancio Pereira
Olá, obrigada pelo questionamento! Não há um comparativo entre as duas metodologias utilizadas, visto que as mesmas foram analisadas em tempos diferentes. A contagem de células totais por azul de trypan foi realizada imediatamente 24h após a superexpressão de Tob2, enquanto a análise de cristal violeta foi realizada 48, 72 e 96h após a superexpressão de Tob2. Os ensaios de cristal violeta foram nomeado como 24, 48 e 72h pois consideram o tempo 0h como o tempo de replaqueamento das células após superexpressão, ou seja, 24h após superexpressão. Peço desculpas se a metodologia e os tempos dos gráficos ficaram confusos, mas segue um link do esquema de como foi realizada a metodologia da superexpressão: https://drive.google.com/file/d/1L8zDQJkYGeNO9-lCKMOwklkRh1la1-jt/view?usp=sharing
Vitor Hugo Luna Rocha de Almeida
Ficou bem claro agora. Obrigado e parabéns pelo trabalho!
Thaís Hancio Pereira
Muito obrigada!
Mariana Teixeira
Como os autores explicam a dualidade de TOB2 em termos proliferativos?
Thaís Hancio Pereira
Olá, obrigada pelo questionamento! O papel de Tob2 ainda é pouco compreendido em células tumorais, bem como a regulação do mesmo nessas células. Grande parte dos trabalhos sobre Tob2 até a presente data relacionam sua expressão a uma atividade antiproliferativa, principalmente devido ao fato do mesmo pertencer a uma família de proteínas antiproliferativa. Sendo assim, ainda é difícil compreender por quais mecanismos Tob2 pode estar induzindo a proliferação celular. Nós já levantamos algumas hipóteses, como por exemplo Tob2 estar sofrendo alguma modificação pós-traducional, como fosforilação por exemplo, e estaria sendo inativado, perdendo sua função de induzir parada no ciclo celular, ou até mesmo induzindo a progressão no ciclo. Alguns trabalhos recentes vêm demonstrando que a fosforilação de Tob2 em resíduos específicos podem levar a sua ligação à maquinaria de deadenilação de mRNA e em outros resíduos impedir essa ligação. Dessa forma, a fosforilação de Tob2 teria um papel na regulação global de mRNAs, o que poderia impactar na proliferação celular, dependendo dos alvos deadenilados. No geral, acreditamos que o papel de Tob2 no processo de deadenilação de mRNA e possíveis modificações pós-traducionais possam explicar essa dualidade em termos proliferativos.
Mariana Teixeira
Obrigada pela resposta! Nesse contexto... Foi feita alguma análise do ciclo de celular?
Thaís Hancio Pereira
Nada! Ainda não analisamos o perfil de ciclo celular nas células com Tob2 superexpresso ou inibido, mas este é um dos próximos passos deste trabalho.
Mariana Teixeira
Ok, obrigada. Parabéns pelo trabalho!
Araci Rondon
Olá Thaís,
Excelente apresentação!
Achei que você foi um pouco discreta no título, já que você viu outras características além de proliferação, como formação de colônia (sobrevivência?), regulação entre Myc e Tob2...
Você está pensando em outra alternativa para reduzir ou deletar Tob2 para conseguir ver efeitos maiores nos experimentos da figura 6?
Abraços e boa sorte!
Araci
Thaís Hancio Pereira
Olá Araci, muito obrigada pelos comentários! Nós acreditamos que com aumento do número de Ns nos experimentos de inibição por siRNA de Tob2 já seja possível ver um efeito mais proeminente na proliferação celular e no potencial clonogênico. No momento um dos nossos objetivos é a geração de uma linhagem com expressão sustentada de Tob2 para avaliarmos por tempos maiores e de maneira mais homogênea o efeito de Tob2 tanto na proliferação e potencial clonogênico, quanto na avaliação do feedback de regulação entre Myc e Tob2. Acredito que a linhagem com expressão sustentada de Tob2 já nos dê uma resposta mais forte sobre o papel dele e sua regulação nas células. Claro que no mundo ideal seria muito interessante ter os dois modelos: uma linhagem com expressão sustentada de Tob2 e uma linhagem com Tob2 silenciado para investigar se observamos os mesmos efeitos contrários que vemos nas superexpressão e inibição transientes. Essa é sempre uma ideia pra se ter em mente! Abraços!
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Thaís Hancio Pereira
Olá, obrigada pelo questionamento! A avaliação do conteúdo proteico basal tanto de Myc quanto de Tob2 na figura 1C, foram realizadas em células que não passaram por nenhum processo a não ser o cultivo e manutenção com meio de cultura e Soro fetal bovino. Enquanto isso, as células da figura 2B/C/D passaram pelo processo de transfecção transiente lipossomal , um processo que gera certo estresse na célula, podendo alterar a expressão de algumas proteínas e vias de sinalização. Portanto a diferença na expressão de Tob2 nas linhagens analisadas de maneira basal e das linhagens que receberam o vetor vazio (pcDNA5) pode estar relacionada ao estresse gerado no processo de transfecção lipossomal.
Vitor Hugo Luna Rocha de Almeida
Thaís Hancio Pereira
De nada!