Proceedings of Oncobiology Symposiums
Proceedings of XIV Oncobiology Symposium

Olá, obrigada pelo questionamento! A avaliação do conteúdo proteico basal tanto de Myc quanto de Tob2 na figura 1C, foram realizadas em células que não passaram por nenhum processo a não ser o cultivo e manutenção com meio de cultura e Soro fetal bovino. Enquanto isso, as células da figura 2B/C/D passaram pelo processo de transfecção transiente lipossomal , um processo que gera certo estresse na célula, podendo alterar a expressão de algumas proteínas e vias de sinalização. Portanto a diferença na expressão de Tob2 nas linhagens analisadas de maneira basal e das linhagens que receberam o vetor vazio (pcDNA5) pode estar relacionada ao estresse gerado no processo de transfecção lipossomal. 

De nada!

Olá, obrigada pelo questionamento! Ainda não sabemos se essa regulação ocorre de maneira direta ou indireta, mas nossa hipótese é que Tob2 regula negativamente Myc através da deadenilação de seu mRNA, como já foi observado por Ogami e colaboradores em 2014 (doi:10.1038/onc.2012.548), ao passo que Myc pode regular Tob2 através da expressão do miR-378, como observado por Feng e colaboradores em 2011 (doi: 10.1038/onc.2010.602).

Olá, obrigada pela pergunta! Nós hipotetizamos que o aumento da proliferação nas células transfectadas com Tob2 seja independente do possível mecanismo de regulação entre Myc e Tob2, visto que nem todas as linhagens apresentam diminuição de Myc mediante superexpressão de Tob2, mas todas elas apresentam aumento na proliferação celular avaliada por cristal violeta e/ou aumento do potencial clonogênico mediante superexpressão. Dessa maneira o aumento de proliferação nessas células está relacionada ao aumento de Tob2, mas ainda não sabemos por qual mecanismo Tob2 está influenciando positivamente da proliferação celular. 

Muito interessante, nunca tinha pensado em Tob2 levando a deadenilação do mRNA de um supressor tumoral, levando a essa instabilidade. Vou levar isso em consideração! Muito obrigada pelo palpite!

Recentemente saiu um trabalho que mostra que a fosforilação de Tob2 em diferentes resíduos pode inibir ou aumentar a sua ligação à maquinaria de deadenilação, e isso teria impacto na proliferação celular por essa mudança global de mRNAs (doi: 10.1261/rna.073528.119). Nosso chute iria mais ou menos por essa linha, em relação ao mecanismo pelo qual ele estaria atuando como indutor de proliferação. 

Olá, obrigada pelo questionamento! Não há um comparativo entre as duas metodologias utilizadas, visto que as mesmas foram analisadas em tempos diferentes. A contagem de células totais por azul de trypan foi realizada imediatamente 24h após a superexpressão de Tob2, enquanto a análise de cristal violeta foi realizada 48, 72 e 96h após a superexpressão de Tob2. Os ensaios de cristal violeta foram nomeado como 24, 48 e 72h pois consideram o tempo 0h como o tempo de replaqueamento das células após superexpressão, ou seja, 24h após superexpressão. Peço desculpas se a metodologia e os tempos dos gráficos ficaram confusos, mas segue um link do esquema de como foi realizada a metodologia da superexpressão: https://drive.google.com/file/d/1L8zDQJkYGeNO9-lCKMOwklkRh1la1-jt/view?usp=sharing

Muito obrigada!

Olá, obrigada pelo questionamento! O papel de Tob2 ainda é pouco compreendido em células tumorais, bem como a regulação do mesmo nessas células. Grande parte dos trabalhos sobre Tob2 até a presente data relacionam sua expressão a uma atividade antiproliferativa, principalmente devido ao fato do mesmo pertencer a uma família de proteínas antiproliferativa. Sendo assim, ainda é difícil compreender por quais mecanismos Tob2 pode estar induzindo a proliferação celular. Nós já levantamos algumas hipóteses, como por exemplo Tob2 estar sofrendo alguma modificação pós-traducional, como fosforilação por exemplo, e estaria sendo inativado, perdendo sua função de induzir parada no ciclo celular, ou até mesmo induzindo a progressão no ciclo. Alguns trabalhos recentes vêm demonstrando que a fosforilação de Tob2 em resíduos específicos podem levar a sua ligação à maquinaria de deadenilação de mRNA e em outros resíduos impedir essa ligação. Dessa forma, a fosforilação de Tob2 teria um papel na regulação global de mRNAs, o que poderia impactar na proliferação celular, dependendo dos alvos deadenilados. No geral, acreditamos que o papel de Tob2 no processo de deadenilação de mRNA e possíveis modificações pós-traducionais possam explicar essa dualidade em termos proliferativos.

Nada! Ainda não analisamos o perfil de ciclo celular nas células com Tob2 superexpresso ou inibido, mas este é um dos próximos passos deste trabalho.

Olá Araci, muito obrigada pelos comentários! Nós acreditamos que com aumento do número de Ns nos experimentos de inibição por siRNA de Tob2 já seja possível ver um efeito mais proeminente na proliferação celular e no potencial clonogênico. No momento um dos nossos objetivos é a geração de uma linhagem com expressão sustentada de Tob2 para avaliarmos por tempos maiores e de maneira mais homogênea o efeito de Tob2 tanto na proliferação e potencial clonogênico, quanto na avaliação do feedback de regulação entre Myc e Tob2. Acredito que a linhagem com expressão sustentada de Tob2 já nos dê uma resposta mais forte sobre o papel dele e sua regulação nas células. Claro que no mundo ideal seria muito interessante ter os dois modelos: uma linhagem com expressão sustentada de Tob2 e uma linhagem com Tob2 silenciado para investigar se observamos os mesmos efeitos contrários que vemos nas superexpressão e inibição transientes. Essa é sempre uma ideia pra se ter em mente! Abraços!