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Log inIntroduction and objectives: Among osteopontin splice variants (OPN-SVs), osteopontin-4 (OPN4) and osteopontin-5 (OPN5) have been recently described in esophageal carcinoma cells. However, their expression profiling in distinct cancer types and putative roles in cancer cells has not been addressed. The present work aimed to investigate the expression of OPN4 and OPN5 isoforms in several cancer cell lines and in distinct corresponding tumor and non-tumor samples, besides evaluating their expression levels in relation to the previously described OPN-SVs: OPNa, OPNb, and OPNc. Material and Methods: Total RNA from cancer cell lines, including prostate (PC3 and DU145), ovarian (A2780), breast (MCF-7, and MDA-MB-231), thyroid (TT, TPC1, and 8505c) and lung (A549 and H460) cancer were extracted, followed by cDNA synthesis. OPN-SVs transcript analysis were performed using isoform-specific oligonucleotides and GAPDH and actin genes were used as normalization controls. One-Way ANOVA and Kruskal-Wallis tests were used for statistical analysis. For the OPN4 and OPN5 in silico expression analysis, were used GEPIA2 (http://gepia2.cancer-pku.cn/) and TSVdb (http://www.tsvdb.com/) online software tumor database. Mann-Whitney U test was applied for in silico statistical analysis. Results and conclusion: We found that OPN4 and OPN5 variants are expressed in most of tested tumor cell lines. In addition, OPN4 and OPN5 transcripts displayed co-expression in most tested cell lines. OPN4 was found expressed in similar or higher levels in relation to OPN5. Moreover, in most cell lines, OPN4 is also expressed in similar levels to OPNa or OPNb. The expression of OPN5 is also generally variable in relation to the other OPN-SVs, but expressed in similar or higher levels in relation to OPNc, depending on each tested cell line. The expression of OPN4 and OPN5 was also evaluated in silico in tissue samples, and we found that these isoforms are overexpressed in distinct tumor types in relation to non-tumor samples, besides being associated to worse survival rates when overexpressed in these same tumors. In conclusion, we provide evidence that these recently described OPN4 and OPN5 are ubiquitously expressed in distinct tumor cell types, besides presenting tumor-specific differential expression levels in relation to the other three previously described OPN-SVs. Moreover, OPN4 and OPN5 are overexpressed in tumor samples, suggesting its potential use as diagnostic and/or prognostic biomarkers in some tumors.
Bruno Ricardo Barreto Pires
Boa tarde, Gabriela! Primeiramente, parabens pelo seu trabalho e tambem pelo video (foi bem importante). Colocarei alguns topicos aqui com algumas duvidas que tive em relacao ao trablaho apresentado:
1) Na figura 2, em que voce mostra a expressao das OPNs nas linhagens celulares, eu gostaria de saber qual condicao voce utilizou como referencia para o calculo dos niveis relativos dos transcritos;
2) Na figura 4, voce mostra os niveis de expressao das OPNs em tecidos tumorais e nao tumorais. Nos sabemos que exitem variaveis que fazem os tumores serem heterogeneos, por exemplo, existem 5 subtipos moleculares no cancer de mama. Dessa forma, voce nao acha que esta perdendo algumas informacoes ao considerar os tecidos tumorais (de cada tipo de cancer) como algo homogeneo?
3) Ultima pergunta: qual eh o impacto clinico da sua pesquisa? Voce imagina o seu estudo sendo aplicado daqui a algumas decadas?
Novamente, parabens pelo trabalho e sucesso na sua carreira!
Nathalia Meireles
Em primeiro lugar, parabéns pelo trabalho! Agora vamos às perguntas: vc saberia me dizer se a OSPN4 e 5 foi descrita em linhagens celulares de carcinoma de esôfago ou em tecido tumoral? E de que subtipo histológico? Vc não acha que, como essas isoformas foram descritas em carcinoma de esôfago, teria sido interessante comparar o nível de expressão delas tb nesses tumores, além dos outros que vc já avaliou? Existe uma expressão diferencial das variantes de osteopontina, de acordo com o subtipo histológico dos tumores? Por exemplo: alguma das isoformas é mais expressa em adenocarcinomas...? vc disse que as isoformas OPN a,b e c são mais bem caracterizadas em relação a sua funcionalidade: quais são as diferenças funcionais entre elas? Qual vc acha que é o impacto do aumento da expressão dessas isoformas em tecidos tumorais quando comparados a tecidos não-tumorais? Como vc poderia avaliar o papel da OPN4 e 5 para o desenvolvimento e/ou progressão tumoral? Por fim, esse trabalho já está finalizado ou vc tem alguma perspectiva de continuação?
Gabriela Ribeiro Silva
Olá Natália, obrigada pelas perguntas.
O primeiro trabalho a mostrar a expressão da OPN4 e da OPN5 foi em amostras de pacientes com adenocarcinoma esofágico primário (Lin, J. et al 2016). Esse estudo mostrou que ambas as isoformas são superexpressas nesse tecido tumoral em comparação com o tecido correspondente não tumoral. No entanto, não é dito qual é o subtipo histológico dessas amostras.
Sim, seria muito interessante avaliar a expressão da OPN4 e OPN5 em linhagens representativas de carcinoma esofágico. Vamos considerar sua sugestão.
Eu avaliei a expressão da OPN4 e OPN5 em diferentes subtipos de carcinomas da tireoide (linhagens TPC1, TT e 8505) e tem diferença sim das isoformas entre esses subtipos tumorais (fig. 2 a,b,c).
A literatura e também nosso grupo tem estudado estas variantes, e em conjunto os estudos mostram que suas funções são tecido e tumor específicas. Por exemplo, no modelo de carcinoma da tireoide, nosso grupo descobriu que OPNa ativa a progressão tumoral no carcinoma papilar da tireoide, enquanto inibe esses aspectos no carcinoma medular da tireoide. Em células de câncer de pulmão, a OPNb afeta a proliferação, enquanto a expressão de OPNc está correlacionada com a invasão de células tumorais.
Enfim, são diversos achados sobre a OPNa, OPNb e OPNc. E o meu projeto está interessado em saber a contribuição da OPN4 na progressão tumoral. Nossa hipótese é que a OPN4 contribua na carcinogênese, estimulando angiogênese, migração e invasão celular.
Sendo, futuramente, confirmada essa hipótese, e sabendo que essa isoforma possui uma expressão diferencial entre tecido normal e tumoral, será possível apontar essa isoforma como um potencial biomarcador diagnóstico (e quem sabe, como um alvo terapêutico).
Esse trabalho não esta concluido. Devido a pandemia, infelizmente, os ensaios foram interrompidos provisoriamente. Mas pretendo ter esses resultados até o final do ano que vem.
Novamente quero agradecer pela atenção. Atenciosamente, Gabriela.
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Gabriela Ribeiro Silva
Eu que agradeço, Bruno, pelas suas perguntas.
Sobre a sua primeira questão, nós não utilizamos nenhuma amostra como referencial. A expressão gênica de cada isoforma da OPN foi calculada usando o método 1 / ΔCT. O valor ΔCT foi calculado aplicando o seguinte cálculo: (valor de CT de cada isoforma da OPN) - (CT do gene constitutivo). Nesse método não se usa amostra como comparativo, e tem-se um padrão de expressão global do gene normalizado apenas pelo constitutivo. Resumindo: meu objetivo não é comparar uma amostra com as demais, e sim avaliar na amostra estudado ( distintas linhagens ) os níveis de expressão das mesmas, tendo um panorama das que expressam níveis maiores ou menores das isoformas, mas sem comparar com uma amostra de referência.
Em relação a sua segunda pergunta, sim, com certeza a expressão da OPN pode variar conforme os subtipos do tumor. Em tumores mais agressivos e em estágios mais avançados da doença, espera-se que a expressão da OPN seja maior do que nos estágios iniciais. No entanto, em um primeiro momento a inteção do trabalho era identificar se a OPN-4 e a OPN-5 (as variantes da OPN recentemente descritas e que, até o momento, não se sabia o nível de expressão de ambas) apresentam, de uma forma geral, expressão diferencial nos tumores se comparada com os tecidos correspondentes não tumorais. Agora que sabemos que há essa diferença, podemos aprofundar, futuramente, e pesquisar se há diferença na expressão entre os diferentes subtipos do tumor.
Por fim, sobre a aplicação clínica. Nessa sessão de poster, mostrei os resultados iniciais do meu trabalho de mestrado. Pretendemos, em uma segunda etapa, avaliar o papel da OPN-4 na tumorigênese do carcinoma papilar da tireoide por meio do silenciamento da expressão e a realização de testes funcionais. Nossa hipótese é que a OPN-4 contribua na carcinogênese desse tumor, estimulando angiogênese, migração e invasão celular. Sendo, futuramente, confirmada essa hipótese, e sabendo que essa isoforma possui uma expressão diferencial entre tecido normal e tumoral, será possível apontar essa isoforma como um potencial biomarcador diagnóstico (e quem sabe um alvo terapêutico) neste tumor.
Novamente, gostaria de agradecer pela atenção. Espero ter sanado suas dúvidas. Atenciosamente, Gabriela.
Bruno Ricardo Barreto Pires
Obrigado, Gabriela! Voce respondeu bem a todas as perguntas. Mais uma vez, parabens pelo trabalho.