Na pecuária leiteira, a mastite bovina representa um importante desafio, pois é responsável por perdas econômicas consideráveis relacionadas principalmente com a redução na produção e qualidade do leite. O objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos do principal agente etiológico da mastite bovina ambiental, Escherichia coli, de casos de mastite bovina subclínica na região de Londrina-PR. Foram coletados assepticamente cerca de 10 mL de leite de 52 vacas com mastite bovina subclínica detectadas através de CMT (“California Mastitis Test”), no qual foram mantidos sob refrigeração até a chegada ao laboratório, onde foi plaqueado 100 µL do leite em ágar MacConkey e incubado por 24 horas a 37ºC. Duas a três colônias de cada placa foram submetidas a provas bioquímicas (Enterokit - Probac®) para identificação de E. coli. Colônias de E. coli confirmadas através das provas bioquímicas foram submetidas ao teste de sensibilidade, seguindo as recomendações do CLSI (“Clinical and Laboratory Standarts Institute”), para os seguintes antimicrobianos: ácido nalidíxico, amoxicilina-ácido clavulânico, ampicilina, aztreonam, cefotaxima, cefoxitina, cloranfenicol, ciprofloxacina, enrofloxacina, estreptomicina, gentamicina, imipenem, tetraciclina, e sulfametoxazol-trimetoprim. Um total de 19 cepas de E. coli foram isoladas das 52 amostras de leite de vacas com mastite subclínica, das quais, duas cepas (10,5%) apresentaram resistência a pelo menos um antimicrobiano. Dos dois isolados, um apresentou resistência apenas para a tetraciclina, enquanto o outro isolado apresentou resistência a ampicilina, estreptomicina, tetraciclina e sulfametoxazol-trimetoprim. Todos os isolados de E. coli foram susceptíveis aos demais antimicrobianos. Apesar da baixa frequência de isolados resistentes aos antimicrobianos, um dos isolados apresentou resistência a quatro antimicrobianos, sendo considerado uma cepa multirresistente. Deste modo, faz-se necessário a utlização correta de antimicrobianos na prática veterinária, com intuito de diminuir a seleção de bactérias resistentes, pois o leite mastítico pode ser considerado uma potencial fonte de contaminação de bactérias multirresistentes para nós humanos, especialmente quando esse leite é usado na produção de queijos crus e produtos fermentados.