A água é um recurso natural essencial, e deve estar livre de contaminantes, tais como os microrganismos que podem ser transmissores de doenças de veiculação hídrica. Há incidência de leveduras que são fungos presentes no ambiente em água para consumo humano. O uso da técnica de Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) utilizando a região ITS universal é uma importante ferramenta para detecção e identificação de microrganismo. O estudo teve como objetivo realizar a identificação molecular de leveduras isoladas de amostras de águas subterrâneas da cidade de Dourados, Mato Grosso do Sul, Brasil. A amostras da água foram coletadas em 16 poços tubulares no período de setembro a dezembro de 2015. As leveduras foram isoladas pela técnica da membrana filtrante. Em seguida, o DNA foi extraído com o kit YeaStar^TM Genomic DNA Kit (Zymo Research, EUA) e a amplificação da região ITS universal foi realizada por PCR. As amostras foram purificadas e sequenciadas em ABI 3500 automatizado utilizando os primers e ciclos originais com BigDye. A qualidade de cada electroferograma foi avaliada utilizando BioEdit e sequências de consenso (contigs) foram obtidas usando o software CAP3. Os contigs foram comparadas com as sequências depositadas no GenBank. Foram isoladas 19 leveduras, destas seis foram identificadas como Candida parapsilosis e duas como Exophiala dermatidis, Sarocladium zeae, Hanseniaspora opuntiae. Somente um isolado de Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Clavispora lusitaniae, Rhodotorula mucilaginosa, Kazachstania aeróbia, Rhodosporidium toruloides. Neste estudo foi possível identificar leveduras patogênicas oportunistas, fitopatogênicas, decompositoras e de interesse industrial. Assim, essas leveduras apresentam um potencial patogênico para os indivíduos imucomprometidos, tornando desta forma, um problema para a saúde da comunidade que consome essa água. As análises para a presença de coliformes totais e fecais são preconizadas pelo Ministério da Saúde para indicar a qualidade de água a ser consumida, porém observa-se a necessidade de outros testes microbiológicos para considerar a água própria para o consumo humano, uma vez que a existência de microrganismos patogênicos oportunistas pode trazer malefícios para a população.