O objetivo deste estudo foi investigar o efeito da co-fermentação de vinhaça (10gDQO.L-1) com soro de queijo, de forma crescente (2;4;6;8gDQO.L-1) e do tempo de detenção hidráulica (TDH) na produção de hidrogênio em reator anaeróbio de leito fluidizado termofílico (55oC). Reduzindo o TDH de 8 para 2h verificou-se máximos rendimento (HY), produtividade (PVH) e porcentagem de H2 (H2%) de 1,03 ± 0,37mmol H2.g DQO-1, 2,50 ± 0,62L H2.h-1 e 47,0 ± 3,5%, respectivamente, em 6h. A produção de H2 foi reprimida com o aumento da concentração de soro acima de 2gDQO.L-1, com máximos HY, PVH e H2% de 0,78 ± 0,13mmol H2.g DQO-1, 1,41 ± 0,24L H2.h-1 e 52,0 ± 4,6%, respectivamente, no TDH de 8h. A co-fermentação de vinhaça com 2gDQO.L-1 de soro de queijo aprimorou os valores de PVH, H2% e HY em 93,1%, 100% e 81.4%, respectivamente, ambos no TDH de 8h. Os principais metabólitos encontrados foram o ácido succínico, butírico e metanol, caracterizando a rota butírica de produção de hidrogênio.