A poluição de água doce consiste numa diminuição da disponibilidade da quantidade de água para o abastecimento público. Os interferentes endócrinos (IE) podem ser definidos como substâncias exógenas que alteram a função do sistema endócrino e podem causar efeitos adversos ao homem. Portanto, o presente estudo tem por objetivo desenvolver e validar metodologia analítica utilizando a técnica de extração em fase sólida (SPE), com detecção por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodo (HPLC-DAD) para determinação dos hormônios naturais: estrona (E1), 17β-estradiol (E2), Estriol (E3) e o hormônio sintético 17α-etinilestradiol (EE2) em águas superficiais do açude Santo Anastácio. Foram coletadas amostras nos pontos de entrada e saída do corpo hídrico, e os resultados obtidos foram inferiores a 1,29 μg.L-1 para E1, 2,97 μg.L-1 para o E2, 3,31 μg.L-1 para o E3 e 0,86 μg.L-1 para o EE2, provavelmente devido aos seus altos valores de coeficiente de partição.