A levana é um homopolímero de D-frutoses unidas por ligações glicosídicas β-(2→6) e com ramificações β-(2→1) apresentando várias aplicações industriais e para isso, se faz necessário estabelecer processos de produção mais eficientes e em menor tempo. Assim o objetivo principal deste estudo foi elevar a produção da levana por Bacillus subtilis natto, utilizando a metodologia estatística. Um delineamento composto central rotacional 2² (DCCR) foi utilizado com as variáveis: (X₁) sacarose (300, 350 e 400 g L^-1) e (X₂) pH inicial (6,0, 7,0 e 8,0) sendo a resposta (Y₁) produção de levana (gL^-1). As fermentações foram realizadas em frascos de Erlenmeyer com o meio de fermentação contendo (gL^-1): sacarose em diferentes concentrações; extrato de levedura 2; KH₂PO₄, 1; (NH₄) ₂SO₄, 3; MgSO4 (7H₂O) 0,6; MnSO4 0,2; citrato de amônio 0,25, a 37 °C, 150 rpm durante 24 h. A concentração celular foi padronizada a 0,2 gL^-1 para todas as fermentações. Ao final das fermentações a levana produzida foi precipitada do sobrenadante com etanol absoluto na proporção de 3:1 (0,9 mL de etanol: 0,3 mL do sobrenadante) durante 12 h a 4 °C, a levana foi hidrolisada com HCl (0,1 M) por 1 h a 100 °C, neutralizada com NaOH (2 M) e quantificada por açúcares redutores (método de Somogyi e Nelson), utilizando frutose como padrão. As maiores produções de levana foram de 154,7 gL^-1 (420,7 g L^-1 de sacarose, pH 7.0) e 149,4 gL^-1 (400 g L^-1 de sacarose, pH 8.0). Menores concentrações de sacarose levaram à redução na produção de levana alcançando 92,0 gL^-1 (279,2 gL^-1 de sacarose em pH 7.0). Pela análise de variância (ANOVA) constatou que a sacarose (X₁) foi significativa (p<0,05) e o modelo pode ser utilizado para fins preditivos, pois a falta de ajuste não foi significativa (p=0,994). A produção de levana por B. subtilis natto foi otimizada e o valor previsto foi de 156,51 gL^-1 (420,7 gL^-1 de sacarose e pH 8.0) próximo ao obtido de 154,7 gL^-1. As variabilidades podem ser explicadas em 99 %, indicando que o modelo está adequado. Os resultados confirmaram que altas produções de levana foram atingidas em elevadas concentrações de sacarose e que a metodologia estatística reduziu o tempo e os custos do processo.